尹偉+孫啟才

【摘 要】傳染性法氏囊?。↖BDV）是目前危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。本文對傳染性法氏囊病作了簡介，從IBDVD 病理組織學、細胞免疫學、抗原變異、毒力以及病毒復(fù)制入手，探討IBDV的致病機理。從IBDV 誘導(dǎo)細胞凋亡，炎癥反應(yīng)，免疫抑制等方面探討其分子致病機理。隨著對傳染性法氏囊病毒致病機制研究的不斷深入，以期為設(shè)計抗病毒藥物奠定基礎(chǔ)，為該病的預(yù)防提供理論依據(jù)和線索。

【關(guān)鍵詞】傳染性法氏囊??；細胞凋亡；致病機理

0 前言

傳染性法氏囊病（IBDV）是目前危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。該病被發(fā)現(xiàn)已有半個世紀，至今仍一直遍布世界各養(yǎng)禽區(qū)域，在工業(yè)化養(yǎng)禽業(yè)發(fā)達國家尤甚。近年來，超強毒株和變異毒株的出現(xiàn)使得該病的發(fā)生和流行出現(xiàn)了新的特點，對養(yǎng)禽業(yè)的造成了巨大危害。深入了解該病的致病機制，提供有效地預(yù)防和控制該病的策略，具有重大的現(xiàn)實意義。IBDV的分子致病性研究經(jīng)歷了幾個階段：早期主要通過病理組織學變化、細胞免疫學分析進行研究，隨后伴隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，研究主要集中在與抗原變異、毒力以及病毒復(fù)制上，而目前主要通過高通量的方法篩選與病毒蛋白互作的宿主蛋白，然后進一步對篩選的相互作用蛋白進行驗證，該方法的應(yīng)用使得越來越多的致病性相關(guān)的因子被揭示，為進一步來闡釋病毒的分子致病機理奠定了理論基礎(chǔ)。

1 傳染性法氏囊病簡介

傳染性法氏囊病（infectious bursal disease， IBD）是禽類的一種病毒性免疫抑制性疾病，病毒主要通過侵害3-6周齡雛雞的法氏囊中樞免疫器官，破壞表面帶有sIgM的B淋巴細胞，并引起脾臟、胸腺及外周血液淋巴細胞的凋亡，導(dǎo)致以淋巴細胞衰竭、壞死為主要特征的一種免疫缺陷性和免疫抑制性疾病，其所致的急性炎性反應(yīng)和細胞凋亡結(jié)果使B淋巴細胞急劇減少，導(dǎo)致免疫抑制，使感染雞對其他病原的易感性增強 ，根據(jù)病毒中和特性不同可將IBDV分成對雞和火雞均致病血清Ⅰ型和只對火雞致病的血清Ⅱ型。根據(jù)抗原性變異和毒力的不同，血清Ⅰ型毒株又分為經(jīng)典毒株（classical virulent IBDV， cIBDV）、疫苗株（attenuated IBDV）、抗原變異毒株（antigenic variant IBDV）和超強毒株（very virulent IBDV， vvIBDV）[1]。

傳染性法氏囊病是一種高度接觸性傳染病，自然條件下，該病的傳播主要以口腔傳播為主，也可經(jīng)蛋垂直傳遞，各種用具、人員及昆蟲也可以攜帶病毒，進行擴散傳播。病毒進入體內(nèi)主要通過巨噬細胞的吞噬作用擴散到其他組織和器官。經(jīng)典毒株可引起感染雞群法氏囊炎癥和嚴重的淋巴細胞壞死，法氏囊水腫，導(dǎo)致免疫抑制和一定水平的死亡率。一般來說，感染后第3天是死亡高峰期，但感染后5-7天仍有死亡發(fā)生，使得整個雞群死亡率可高達20%-30%。疫苗株是經(jīng)雞胚成纖維細胞或其他細胞系適應(yīng)的毒株，對雞不致病，因此一些毒株可作為活苗免疫雞群。超強毒株，該病原能引起典型的IBDV損傷，法氏囊嚴重出血，外觀呈“紫葡萄狀”，現(xiàn)已大面積流行于歐洲、東南亞、非洲等。其致死率高達60%-100%?？乖儺惗局甑奶攸c在于能夠突破經(jīng)典疫苗毒株的免疫保護，與抗經(jīng)典毒株血清交叉中和，感染變異毒株的雞群法氏囊嚴重萎縮卻不表現(xiàn)炎性癥狀。

IBDV屬雙RNA病毒科（Birnaviridae）禽雙RNA病毒屬（Avibirnavirus）。病毒粒子呈二十面體對稱，無囊膜，T=13晶格分布，直徑約60 nm。病毒基因組為雙股雙節(jié)段RNA（double-stranded RNA， dsRNA），有A和B兩個片段組成。病毒基因組A片段全長由約3.3 kb核苷酸組成[2]，包含兩個部分重疊的開放閱讀框（open reading frames， ORFs）。

2 IBDV的致病機理

2.1 IBDVD 病理組織學、細胞免疫學研究

病毒感染宿主后主要臨床表現(xiàn)包括精神高度萎靡、縮頭、閉眼、呆立，羽毛蓬松，采食量明顯減少，飲水急劇增加，白色水樣稀糞，自啄肛門。該病往往突然發(fā)生，通常在感染第3天開始死亡，4-6天達到高峰，以后很快停息，表現(xiàn)為高峰死亡和迅速康復(fù)的曲線。當前傳染性法氏囊病呈現(xiàn)出新的特點，近年來國內(nèi)外陸續(xù)報道分離出IBDV變異毒株，其致病特點以出現(xiàn)亞臨床傳染性法氏囊病癥狀為主，沒有經(jīng)典毒株所致的高死亡率及典型的腿肌出血等癥狀，不引起明顯的炎癥反應(yīng)，感染雞群死亡率不高，但可引起肝臟壞死和明顯的脾臟腫大，最典型的病變是病雞法氏囊迅速萎縮，導(dǎo)致嚴重的免疫抑制。而且發(fā)病日齡呈現(xiàn)兩極化趨勢，發(fā)病越早，免疫抑制越嚴重，傳染性法氏囊病繼發(fā)癥增多。免疫學研究認為法氏囊是IB DV的靶器官，其中B 細胞對IBDV 敏感， 帶sIg M 的B 細胞為IBDV的主要靶細胞，而胸腺T 細胞對IBDV不易感，有報道指出， 感染IBDV 雛雞胸腺細胞出現(xiàn)壞死變化[3]，1日齡雛雞感染IBDV 后外周血液白細胞數(shù)量減少。

2.2 抗原變異、毒力以及病毒復(fù)制

2.2.1 抗原變異與毒力

VP2高變區(qū)內(nèi)的兩個大親水區(qū)、三個小親水區(qū)是構(gòu)成IBDV抗原變異的分子基礎(chǔ)。第1個親水區(qū)的氨基酸不直接結(jié)合mAbs，主要起穩(wěn)定抗原表位構(gòu)象的作用，變異株E的213和222位氨基酸的突變引起VP2蛋白的中和性表位的構(gòu)象改變；第2個親水區(qū)的2個氨基酸突變可能對變異株逃逸病毒中和抗體的能力是一個關(guān)鍵，且對結(jié)合mAbs的特異性也至關(guān)重要。這2個親水區(qū)是病毒中和表位的組成部分，特別是第2個親水區(qū)的氨基酸改變導(dǎo)致變異株E對標準株疫苗介導(dǎo)的抗體中和作用有抵抗力各標準株的親水區(qū)序列完全保守，而在變異株中卻有數(shù)量不等的氨基酸被替代。第一個大親水區(qū)（212-224aa）殘基置換不影響抗體結(jié)合，但對抗原的構(gòu)象穩(wěn)定性有較大的影響[4]，而第二個大親水區(qū)（314-324aa）是單抗結(jié)合必需的，該區(qū)的氨基酸替代可致變異株逃逸抗體的中和作用。

2.2.2 IBDV的復(fù)制

IBDV的復(fù)制和增殖是研究其生物學特性的基礎(chǔ)，IBDV能夠在多種類型的細胞中復(fù)制，如雞源細胞： 雞胚法氏囊細胞（ CEB ）、雞胚腎細胞（CEK ）、雞胚成纖維細胞（CEF） ；非雞源細胞包括火雞胚成纖維細胞 （ TEF）， 鶴鶉胚（ QEF ）成纖維細胞，鴨胚成纖維細胞（ DEF ）， 兔腎細胞 （ PK-13 ）， 幼綠猴腎細胞（ BGM-70 ），猴腎細胞（ Vero）。IBDV在細胞中的增殖周期因細胞而異。Burkhardt等發(fā)現(xiàn)血清I 型IBDV在CEF中潛伏期為4-6 h 。目前研究中積累了大量的不同IBDV毒株在各種細胞中增殖特點的資料，闡明了組成病毒各蛋白組分的特點和功能，測定了一些病毒的全部核苷酸序列，提出了病毒致病力和抗原性差異的一些分子基礎(chǔ)，但對病毒增殖過程、病毒與敏感細胞間相互作用的機制仍知之較少。其原因主要有： 即使在產(chǎn)生高滴度病毒時，也僅僅是有限的培養(yǎng)細胞被感染而支持病毒的復(fù)制。目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)IBDV 可能通過受體介導(dǎo)接入宿主細胞進行復(fù)制，已發(fā)現(xiàn)的相關(guān)受體有細胞膜上的a4β1整合素（integrin）、雞熱應(yīng)激蛋白-90（HSP90）以及B 細胞表面IgM（sIgM）。

3 IBDV分子致病機理

3.1 IBDV 誘導(dǎo)的細胞凋亡

IBDV感染引起細胞凋亡和細胞壞死是法氏囊內(nèi)淋巴細胞衰竭的兩個重要原因。細胞凋亡是指機體清除多余、變異或惡化細胞的一種主動的、程序化的生理過程。體外試驗表明， IBDV可以引起多種動物細胞系發(fā)生凋亡。且各細胞系發(fā)生凋亡的時間各不一樣，CEF 細胞在感染早期（ 病毒吸附CEF后）就可誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，而Vero細胞則在感染夠6小時才開始凋亡。大量研究表明，細胞凋亡過程中需要新的基因表達，而且細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核以及原癌基因、細胞周期蛋白、細胞骨架、受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、細胞因子和免疫蛋白等都與細胞凋亡密切相關(guān)。葉研究比較了IBDV感染前、后兩個Vero文庫間基因表達的差異，將顯著差異基因的KEGG和Bioarta數(shù)據(jù)庫內(nèi)進行搜索與分析，初步分析顯現(xiàn)，在IBDV感染過程中細胞凋亡的可能機制之一是：Gadd45a結(jié)合EF-1α蛋白，抑制其穩(wěn)定微管聚合的作用，Bim蛋白得以由細胞骨架解離并轉(zhuǎn)位于線粒體，導(dǎo)致細胞色素C釋放，激發(fā)線粒體凋亡途徑。這提示細胞受到損傷后細胞骨架穩(wěn)定性的改變在細胞凋亡發(fā)生過程中起重要作用。生物內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定不但依賴于細胞的增殖分化，也依賴于細胞的凋亡。目前認為dsRNA主要通過活化PKR和OAS/RnaseL通路抑制蛋白合成或dsRNA敏感機制激活Caspase-8途徑誘導(dǎo)凋亡[5]。然而，病毒復(fù)制依賴于宿主細胞器的合成功能，如果細胞凋亡過快，病毒則不能完成復(fù)制，故有些病毒本身又帶有抑制細胞凋亡因子，延緩細胞死亡有利于病毒的復(fù)制。

3.2 IBDV 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

宿主T 細胞可抗拒IBDV病毒感染并促進病毒清除，但是其調(diào)節(jié)機制還不清楚。Abdul Rauf等人通過CD4+ 和 CD8+ T細胞滲入法氏囊對病毒分子致病機制和細胞毒性T細胞的病毒清除機制進行了研究。研究結(jié)果表明：一些重要的細胞因子如穿孔素（PFN）、粒酶A（Gzm-A）、DNA修復(fù)凋亡蛋白、高速流動性蛋白（HMG）、多聚ADP核糖聚合酶（PARP）、Th1、 IL2 和 IFN-r顯著上調(diào)，而表達的自然殺傷細胞裂解素則顯著下調(diào)。顯著表達上調(diào)的Th1、 IL2 和 IFN-r，證明了T細胞的激活。巨噬細胞在先天性和獲得性免疫中扮演著重要角色，病毒感染后可調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)增強或減弱巨噬細胞功能從而引起免疫發(fā)病或者免疫逃逸。M. Khatri等人建立了一個IBDV病毒和巨噬細胞在急性感染階段的互作模型，并證明了IBDV感染后可激活巨噬細胞分泌細胞因子和化學物質(zhì)來促進局部炎癥和組織損傷細胞因子可廣泛調(diào)控機體免疫應(yīng)答，但有關(guān)IBDV感染引起細胞因子變化的鮮有報道，最近，劉等人研究發(fā)現(xiàn)不同毒力的IBDV可誘導(dǎo)雞體內(nèi)細胞調(diào)節(jié)免疫相關(guān)細胞因子的表達，細胞因子在超強毒株感染的急性階段扮演著重要角色，且不同毒力的IBDV株通過不同的信號通路引起免疫反應(yīng)。

3.3 IBDV的免疫抑制

1972年， Faragher等人首次報道了IBDV感染后引起雛雞的免疫抑制現(xiàn)象，他們通過研究不同日齡的雛雞在感染IBDV后，新城疫抗體產(chǎn)生的情況，發(fā)現(xiàn)1日齡的雛雞感染IBDV后，對新城疫疫苗免疫后抗體的產(chǎn)生有明顯的抑制作用，并且這種抑制作用會隨感染病毒雛雞日齡的增大而顯著下降，當14或21日齡雛雞感染后，這種抑制作用已不再明顯。隨后的研究證實[6]，IB D V 感染不僅引起雛雞全身體液免疫和細胞免疫功能顯著抑制， 而且導(dǎo)致消化道和呼吸道局部的體液免疫和細胞免疫水平也明顯降低。此外，研究者也證實IBDV的免疫抑制效應(yīng)因毒株不同而表現(xiàn)不同。最新有關(guān)傳染性法氏囊病引起免疫抑制的機理研究，王永強等人發(fā)現(xiàn)VP4 能抑制宿主細胞I 型干擾素的表達，并通過酵母雙雜和CO-IP及激光共聚焦技術(shù)發(fā)現(xiàn)了VP4作用于宿主細胞靶蛋白GLIZ（糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白）。RNAi技術(shù)也證實了VP4通過GLIZ 抑制I型干擾素的表達以及子代病毒的復(fù)制。該結(jié)果初步揭示了IBDV 引起免疫抑制的分子機理。

4 小結(jié)

法氏囊是IBDV感染的靶器官，其所致的急性炎性反應(yīng)和細胞凋亡結(jié)果使B淋巴細胞急劇減少，導(dǎo)致免疫抑制，使感染雞對其他病原易感性增強。IBDV還能感染巨噬細胞，產(chǎn)生不同的細胞因子和化學因子，在IBDV感染宿主的過程中發(fā)揮作用。隨著對傳染性法氏囊病毒致病機制研究的不斷深入，為設(shè)計抗病毒藥物奠定了基礎(chǔ)，為該病的預(yù)防和控制制提供了理論依據(jù)和線索。

【參考文獻】

[1]M. Khatri J.M. Sharma Modulation of macrophages by infectious bursal disease virusCytogenet Genome Res 117：388-393.

[2]Liu， H.， M. Zhang， et al.“Comparison of the expression of cytokine genes in the bursal tissues of the chickens following challenge with infectious bursal disease viruses of varying virulence.”Virol J 2010.7：364[Z].

[3]Stricker RL， Behrens SE， Mundt E.Nuclear factor NF45 interacts with viral proteins of infectious bursal disease virus and inhibits viral replication.J Virol. 2010[Z].

[4]Cui X， Nagesha HS， Holmes IH. Identification of crucial residues of conformational epitopes on VP2 protein of infectious bursal disease virus by phage display[J].J Virol Method，2003，109：75-83.

[5]Heine HG， Haritou M， Failla P， et al. Sequence analysis and expression of the host-protective immunogen VP2 of a variant strain of infectious bursal disease virus which can circumvent vaccination with standard type I strains[J]. J Gen Virol， 1991，72（Pt8）：1835-43.

[6]Li， Y.， C. Wang， et al. .“Synonymous codon usage of the VP2 gene of a very virulent infectious bursal disease virus isolate serial passaged in chicken embryos.”[J] .Biosystems 2011，104（1）：42-47.

[責任編輯：王偉平]