納仁高娃+米焱+杜禹+沈艷+肖建新+呂東晨+艾麗雅+牛思琪

[摘要] 目的 觀察P2X3受體在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型中的作用和意義。 方法 將40只SD大鼠隨機(jī)分為造模組（n=30）和對(duì)照組（n=10）。按照60 mg/kg一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）建立糖尿病大鼠模型。于STZ注射前和注射后第7、14、28天分別測(cè)定大鼠血糖、體重以及機(jī)械性痛閾的變化。造模組又均分為造模1周組、造模2周組、造模4周組三個(gè)亞組。在造模前及造模后1、2、4周利用von Frey hairs法測(cè)定大鼠機(jī)械痛閾，并通過(guò)Real-time法測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)（DRG）P2X3受體的表達(dá)水平。 結(jié)果 肉眼觀察糖尿病大鼠毛色暗淡，尾靜脈采血點(diǎn)愈合緩慢，每日飲水，飲食，尿量顯著增加，表現(xiàn)符合糖尿病大鼠的臨床特征。各模型組血糖濃度均>16.7 mmol/L，各模型組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。糖尿病大鼠體重較對(duì)照組同期大鼠增長(zhǎng)緩慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。造模組機(jī)械痛閾在造模1周后明顯下降（P<0.01），并持續(xù)至4周（P<0.01）；在造模1周后脊髓DRG內(nèi)P2X3受體表達(dá)水平出現(xiàn)顯著上調(diào)（P<0.01）。大鼠P2X3受體表達(dá)水平變化與機(jī)械痛閾的下降存在相關(guān)性。 結(jié)論 糖尿病早期大鼠脊髓DRG P2X3受體表達(dá)即出現(xiàn)上調(diào)，并與疼痛相關(guān)，說(shuō)明P2X3受體可能在糖尿病大鼠周圍神經(jīng)疼痛的發(fā)生及痛敏的維持階段起重要作用。

[關(guān)鍵詞] 糖尿?。籔2X3受體；背根神經(jīng)節(jié)；Real-time法；大鼠

[中圖分類號(hào)] R587.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）12（c）-0004-04

糖尿病的發(fā)病率隨著生活水平的提高不斷上升，嚴(yán)重危害人們的健康，神經(jīng)病理性疼痛是目前危害糖尿病患者的主要慢性并發(fā)癥之一，臨床表現(xiàn)為感覺(jué)異常和疼痛，其中對(duì)機(jī)械刺激表現(xiàn)異常疼痛，稱為痛性糖尿病周圍神經(jīng)病，由于機(jī)制尚不明確，很難治療或無(wú)法治愈[1-5]。P2X3受體的基本結(jié)構(gòu)屬于配體門(mén)控離子通道，P2X3受體亞基最初由脊髓背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）分離出來(lái)[6-7]。神經(jīng)損傷后組織釋放大量ATP，一方面激活突觸后膜P2X3受體，使細(xì)胞膜去極化，Ca2+內(nèi)流，介導(dǎo)快速突觸傳遞；另一方面激活突觸前膜P2X3受體，促使谷氨酸釋放[8]，通過(guò)NMDA和非NMDA系統(tǒng)，介導(dǎo)疼痛信息。本研究旨在建立糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型，探討P2X3受體在其疾病發(fā)展過(guò)程中的作用，為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型的制備及分組

健康成年雄性SD大鼠，體重180～220 g，將其隨機(jī)分為造模組（n=30）和對(duì)照組（n=10），造模組按照不同時(shí)間點(diǎn)分為造模1周組、造模2周組、造模4周組，每組10只；應(yīng)用國(guó)際通用的鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ，Sigma公司）腹腔注射建立糖尿病大鼠模型[9]。大鼠禁食水12 h后，腹腔一次性按照60 mg/kg劑量注射STZ，于注射后48 h，測(cè)量尾靜脈空腹血糖，如果血糖濃度>16.7 mmol/L，認(rèn)為造模成功。對(duì)照組僅注射相同劑量蒸餾水。

1.2 血糖和體重測(cè)定

造模48 h后，應(yīng)用血糖儀對(duì)所有大鼠進(jìn)行尾靜脈空腹血糖測(cè)定；于造模前及造模后1、2、4周進(jìn)行體重測(cè)定。

1.3 痛行為學(xué)觀察

于造模前和造模后1、2、4周對(duì)大鼠進(jìn)行機(jī)械痛閾值的測(cè)定。固定時(shí)間點(diǎn)（上午10：00～12：00），在固定的地點(diǎn)，室內(nèi)環(huán)境盡可能安靜舒適（室溫維持在23℃左右，濕度55%左右）的情況下，給予人為機(jī)械刺激，觀察大鼠的痛行為改變。主要采用von Frey細(xì)絲法，不同規(guī)格的von Frey細(xì)絲（0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、1.0 g）垂直刺激大鼠后足足心處，持續(xù)5～10 s，出現(xiàn)明顯縮足、舔足或抬足行為均視為陽(yáng)性反應(yīng)。刺激強(qiáng)度從弱到強(qiáng)，重復(fù)10次，每間隔3～5 min一次，10次中有6次以上陽(yáng)性反應(yīng)的最小刺激強(qiáng)度視為機(jī)械性痛閾值。

1.4 Real-time觀察P2X3受體蛋白表達(dá)

隨機(jī)取不同組5只SD大鼠，乙醚麻醉后，獲取L4～6 DRG神經(jīng)元，置于冰上放置的玻璃研磨器中，加入1 ml的Trizol（Gibico公司），迅速研磨至無(wú)肉眼可見(jiàn)組織塊。5 min后將各組裂解液吸到1.5 ml RNase EP管中，加入氯仿0.2 ml/管，劇烈振搖15 s，靜置2～5 min。4℃，12 000 r/min，離心10 min。離心后液體分為三層（上層——無(wú)色水樣層為RNA，中層白色為蛋白質(zhì)），小心吸取上層無(wú)色液體移入一個(gè)新的RNase EP管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻，靜置10～30 min，離心（4℃，12 000 r/min，10 min）。棄去上清，沉淀加入冰冷75%乙醇1 ml，漂洗，用移液搶吸取液體，干燥10～20 min，加入20 μl DEPC水溶解，分裝，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，RT及PCR反應(yīng)體系（Promega公司）按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Real-time實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)基因的CT值通過(guò)GAPDH的CT值均一化，即ΔCT=CT目標(biāo)-CTGAPDH，而目標(biāo)基因mRNA相對(duì)豐度值以ΔΔCT值（DD value）表示，ΔΔCT=2-ΔCT。

P2X3引物序列為F：5′-CAACTTCAGGTTTGCCAA-3′；R：5′-TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3′。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察