李小翠+尤紅娟+李向陽+華慧+湯仁仙

[摘要] 目的 研究白藜蘆醇（Res）促進(jìn)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）蛋白誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞PC-3凋亡的作用。 方法 實(shí)驗(yàn)分為TRAIL蛋白組以及聯(lián)合應(yīng)用白藜蘆醇和TRAIL蛋白的聯(lián)合用藥組；采用CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況，確定白藜蘆醇的用藥濃度；通過CCK8法、流式細(xì)胞術(shù)檢測TRAIL蛋白組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖和凋亡情況；分光光度法檢測兩組細(xì)胞caspase-8、caspase-3活性。 結(jié)果 CCK8結(jié)果提示白藜蘆醇的用藥濃度為50 μmol/L；聯(lián)合用藥組PC-3細(xì)胞的增殖率明顯低于TRAIL蛋白組（P<0.05）；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組PC-3細(xì)胞的凋亡率明顯高于TRAIL蛋白組（P<0.05）；caspase活性檢測結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組PC-3細(xì)胞caspase-8、caspase-3的活性明顯高于TRAIL蛋白組（P<0.05）。 結(jié)論 白藜蘆醇能夠促進(jìn)TRAIL蛋白誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞凋亡，為腫瘤的生物學(xué)治療提供新的材料。

[關(guān)鍵詞] 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體；白藜蘆醇；PC-3；凋亡

[中圖分類號] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）12（c）-0008-04

前列腺癌是嚴(yán)重威脅男性健康的腫瘤之一，發(fā)病率居世界腫瘤第六位。雖然內(nèi)分泌治療可以使大多數(shù)患者的病情得到控制和改善，但絕大多數(shù)患者會發(fā)展為激素抵抗性前列腺癌，患者生存率較低。因此，尋找有效的治療手段延長此類患者的生存期，成為目前前列腺癌治療的有效途徑。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）屬于腫瘤壞死因子超家族成員，能夠高特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，且對正常組織細(xì)胞沒有作用[1-4]，因而成為腫瘤生物學(xué)治療新的熱點(diǎn)。白藜蘆醇（Resveratroi，Res）屬多酚類化合物，研究發(fā)現(xiàn)，其不僅具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗氧化等作用，還可抑制乳腺癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長[5-9]。本實(shí)驗(yàn)利用人前列腺癌細(xì)胞PC-3，觀察聯(lián)合應(yīng)用Res和TRAIL蛋白對PC-3細(xì)胞的凋亡情況，證實(shí)Res能夠促進(jìn)TRAIL對PC-3細(xì)胞的凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人前列腺癌細(xì)胞PC-3購自上海中科院細(xì)胞庫；Res購自天津邁迪瑞康公司；重組人TRAIL蛋白購自TEPROTEH公司；AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒購自天根生物公司；CCK8檢測試劑盒購自碧云天公司；caspase-8、caspase-3活性檢測試劑盒購自碧云天公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 CCK8檢測細(xì)胞增殖情況 將處于對數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞以5×104/ml接種于96孔板，首先確定Res的用藥濃度，分別加入Res，濃度為12.5、25、50、100 μmol/L；TRAIL蛋白組每孔加入TRAIL蛋白，濃度分別為25、50、100、200 ng/ml；聯(lián)合用藥組加入Res 50 μmol/L后，每孔再分別加入上述濃度TRAIL蛋白。于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔分別加入CCK8試劑各10 μl，酶標(biāo)儀檢測OD值。以未處理的細(xì)胞作為正常組，以培養(yǎng)基作為空白組。細(xì)胞增殖率%=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（正常組OD值-空白組OD值）×100%。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 將PC-3細(xì)胞以2×105/ml接種于6孔板，培養(yǎng)12 h后，TRAIL蛋白組加入TRAIL蛋白100 ng/ml；聯(lián)合用藥組加入Res 50 μmol/L后加入TRAIL蛋白100 ng/ml，24 h后收集細(xì)胞，具體操作步驟按照AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.3 caspase-8、caspase-3活性檢測 將PC-3細(xì)胞以2×105/ml接種于6孔板，培養(yǎng)12 h后，單獨(dú)應(yīng)用TRAIL蛋白組加入TRAIL蛋白100 ng/ml；聯(lián)合用藥組加入Res 50 μmol/L后加入TRAIL蛋白100 ng/ml，12 h后收集細(xì)胞，分光光度法檢測caspase-8和caspase-3活性，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Res增強(qiáng)TRAIL蛋白對細(xì)胞增殖的抑制作用

Res組細(xì)胞CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)Res濃度為50 μmol/L時，增殖率為（72.61±4.41）%，Res濃度為100 μmol/L時，增殖率為（70.16±3.73）%，較前差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。TRAIL蛋白組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)TRAIL蛋白的濃度為100 ng/ml時，增殖率為（69.05±6.97）%，而TRAIL蛋白濃度200 ng/ml時，PC-3細(xì)胞的增殖率為（67.72±5.68）%，較前差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。當(dāng)TRAIL蛋白濃度為100 ng/ml時，聯(lián)合用藥組PC-3細(xì)胞增殖率為（38.70±2.43）%，與TRAIL蛋白組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表2）。結(jié)果表明，Res能夠明顯增強(qiáng)TRAIL蛋白對PC-3細(xì)胞增殖的抑制作用。

2.2 Res促進(jìn)TRAIL蛋白誘導(dǎo)的凋亡作用

2.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果 TRAIL蛋白組PC-3細(xì)胞的凋亡率為（34.86±1.25）%，聯(lián)合用藥組PC-3細(xì)胞的凋亡率升高至（70.55±2.90）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明Res可以增強(qiáng)TRAIL對PC-3細(xì)胞的凋亡作用（圖1）。

2.2.2 caspase-8、caspase-3活性檢測試劑盒結(jié)果 TRAIL蛋白組caspase-8、caspase-3活性升高，聯(lián)合用藥組升高更明顯，與TRAIL蛋白組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

3 討論

前列腺癌為常見的惡性腫瘤，且發(fā)病率逐年上升，特別對晚期的前列腺癌目前缺少有效的治療方法，因而，尋求新的治療手段是目前急需解決的問題。應(yīng)用有效藥物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前治療腫瘤的重要途徑之一，也是前列腺癌治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

TRAIL通過與細(xì)胞表面的TRAIL受體特異性結(jié)合發(fā)揮促凋亡作用[10-11]，但有些腫瘤細(xì)胞TRAIL受體表達(dá)量較低而限制了TRAIL蛋白的促凋亡作用的發(fā)揮，因而尋找和應(yīng)用能夠提高TRAIL蛋白促凋亡作用的藥物使之能夠更好地發(fā)揮抗腫瘤作用[12]，成為抗腫瘤治療新的突破點(diǎn)。

Res的生物學(xué)作用非常廣泛，除具有強(qiáng)大的抗炎、抗氧化作用外，還對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有明顯的抑制作用[13-17]，但具體機(jī)制尚不清楚，且由于Res具有雌激素樣活性，因而在前列腺癌的治療中備受關(guān)注。已有研究結(jié)果表明，Res能夠促進(jìn)TRAIL蛋白對人肝癌細(xì)胞的凋亡作用[18]，因此，本研究通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)Res是否對TRAIL蛋白誘導(dǎo)的人前列腺癌細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Res能夠抑制PC-3細(xì)胞的增殖，且存在劑量依賴，當(dāng)Res濃度為50 μmol/L時，作用較為明顯，濃度繼續(xù)增高，對細(xì)胞的增殖抑制作用不再增加，因而選用50 μmol/L為聯(lián)合用藥組Res的用藥濃度。TRAIL蛋白組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著TRAIL蛋白濃度增高，PC-3細(xì)胞的增殖率降低，在TRAIL蛋白濃度達(dá)到100 ng/ml后，對細(xì)胞增殖的抑制作用不再提高，因而聯(lián)合用藥組的TRAIL蛋白濃度選用100 ng/ml。在TRAIL蛋白濃度相同的情況下，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖率明顯低于TRAIL蛋白組，說明Res能夠加強(qiáng)TRAIL蛋白對細(xì)胞的增殖抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果同樣顯示，Res能夠顯著提高TRAIL對PC-3細(xì)胞的凋亡作用。由于TRAIL蛋白是通過與死亡受體結(jié)合，活化caspase-8，繼而引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，最后激活下游凋亡執(zhí)行分子caspase-3而引發(fā)凋亡[19-20]。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測了caspase-8和caspase-3的活性，結(jié)果顯示，與單獨(dú)應(yīng)用TRAIL蛋白相比，聯(lián)合用藥組caspase-8和caspase-3的活性明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)Res可以提高TRAIL對PC-3細(xì)胞的凋亡作用，為前列腺癌的治療提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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