張文博, 吳 闖

（遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部， 遼寧 撫順 113001）

三氯甲烷對鹵蟲的急性毒性研究

張文博, 吳 闖

（遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部， 遼寧 撫順 113001）

為評估三氯甲烷對水生生物的毒性影響，以美國大鹽湖鹵蟲為受試生物，采用概率單位法研究了三氯甲烷對鹵蟲的急性毒性效應(yīng)。結(jié)果表明：在25 ℃條件下，三氯甲烷對鹵蟲的24 h LC50為59.574 mg?L-1，95%置信限度：55.015～63.380 mg?L-1；48 h LC50為29.139 mg?L-1，95%置信限度：24.051～32.839 mg?L-1。培養(yǎng)48 h三氯甲烷對鹵蟲的致死作用比24 h顯著增加，且48 h濃度響應(yīng)范圍也小于24 h響應(yīng)范圍。

三氯甲烷；鹵蟲；急性毒性

三氯甲烷又稱氯仿，常溫下為無色透明易揮發(fā)液體，是重要的有機合成原料，還廣泛用作麻醉劑、溶劑和萃取劑，其在工業(yè)上的普遍應(yīng)用使含三氯甲烷的污水排放對水環(huán)境造成污染，并且在水環(huán)境中很難被生物降解。三氯甲烷在地下水中有積蓄作用，其污染行為不僅體現(xiàn)在飲用水中，而且對食品及蔬菜也能造成污染。使用氯消毒的飲用水中游離氯與水中的有機物作用，形成以三氯甲烷為主的鹵素化合物，其含量可達到對人體健康產(chǎn)生危害到處程度。三氯甲烷對人體有致畸、致癌性，對神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)臟具有毒害作用，破壞敏感水生生物的呼吸系統(tǒng)[1]。在美國129種優(yōu)先控制的污染物和中國58種環(huán)境優(yōu)先監(jiān)測和控制的有機物中，三氯甲烷均位于前列。因此，監(jiān)測和評估三氯甲烷對水體的污染程度及其對水生生物的毒性影響也在日益受到關(guān)注。鹵蟲具有個體小、對環(huán)境變化敏感、可隨時獲得且易于保存和培養(yǎng)等優(yōu)點，已被作為一種環(huán)境監(jiān)測生物廣泛用于水生生物毒理學(xué)研究中。本文以大鹽湖鹵蟲為受試生物，研究三氯甲烷對鹵蟲的急性毒性，為三氯甲烷在水體環(huán)境中的監(jiān)測提供實驗依據(jù)及生物學(xué)參考。

1 實驗部分

1.1 受試生物

以美國大鹽湖鹵蟲（Artemia.francisana）作為受試生物，蟲卵購自天津中鹽制鹽工程技術(shù)研究院。大鹽湖鹵蟲卵具有孵化率和成活率比國產(chǎn)鹵蟲卵

高，且更易培養(yǎng)的優(yōu)點。鹵蟲卵在光照培養(yǎng)箱中孵化，孵化條件為（25±1）℃，2 000 lux光照，光照時間比為12∶12（光照，黑暗），小型氣泵充氣攪拌。選取24 h內(nèi)孵出的鹵蟲，轉(zhuǎn)移至另外容器在相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，得到Ⅱ～Ⅲ齡的鹵蟲無節(jié)幼體。試驗前用標(biāo)準(zhǔn)物十二烷基硫酸鈉（SDS）測得所孵化鹵蟲幼體24 h LC50為16.35 mg?L-1，符合ARC-test要求[2]，鹵蟲幼體可以作為受試材料。

1.2 試劑

三氯甲烷（色譜純）購于天津康科德科技有限公司。

1.3 實驗用水

實驗用水采用人工海水，Ph=8.0±0.5，鹽度（35 ±1）‰，其組成為： 23.70 g?L-1NaCl、0.54 g?L-1KCl、6.29 g?L-1MgSO4?7H2O、4.5g?L-1MgCl2?6H2O、0.15 g?L-1CaCl2、0.04 g?L-1NaHCO3和蒸餾水[3]。

1.4 預(yù)試驗

在人工海水中按 0.1%加入三氯甲烷，超聲波助溶，完全溶解后稀釋成所需不同濃度。于50 mL小燒杯中加入25 mL三氯甲烷溶液，投入10只鹵蟲幼體，分為24 h組和48 h組，觀察死亡情況，分別找出24 h 和48 h使全部鹵蟲未發(fā)生死亡的最高濃度和全部死亡的最低濃度，以確定試驗所需濃度范圍。

1.5 急性毒性試驗

在300 mL燒杯中加入150 mL實驗用三氯甲烷人工海水溶液，每只燒杯投入30只Ⅱ～Ⅲ齡的鹵蟲無節(jié)幼體。每個水平設(shè)置2個平行組，取平均值作為結(jié)果，同時設(shè)空白對照。在光照培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)，（25±1）℃，2 000 lux光照，光照時間比為12∶12（光照，黑暗）。實驗過程中不投餌不充氣。分別于培養(yǎng)24 h和48 h記錄各組鹵蟲死亡數(shù)量，在解剖鏡下觀察，以10 s內(nèi)鹵蟲幼體附肢無明顯運動作為死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)。用SPASS19.0進行數(shù)據(jù)分析，用概率單位法求出24 h LC50和48 h LC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)試驗確定三氯甲烷濃度范圍

表1 試驗用三氯甲烷濃度Table 1 Concentration of chloroform in test mg?L-1

經(jīng)過預(yù)試驗，確定培養(yǎng)24 h和48 h三氯甲烷濃度范圍分別如表1所示。各設(shè)置8個濃度組，在此濃度范圍，死亡率介于 0～100%之間，且死亡率隨濃度增加有明顯增加。在預(yù)實驗試驗中，死亡率小于37%和大于63%的濃度組均大于一組，符合美國水生生物急性毒性試驗的質(zhì)量控制要求。

2.2 鹵蟲的中毒癥狀觀察

試驗中發(fā)現(xiàn)，鹵蟲中毒后有一段平穩(wěn)期，泳動情況與對照組相比無異常，濃度越高這段平穩(wěn)期越短。平穩(wěn)期過后，泳動速度變慢，并逐漸沉入水底。從沉入水底至附肢停止擺動死亡經(jīng)歷的時間很短。

鹵蟲對三氯甲烷的中毒癥狀與其他物質(zhì)的中毒癥狀類似，如柴油使鹵蟲活動能力下降，運動遲緩直至沉在水底不停顫動[4]；恩諾沙星也可以使鹵蟲出現(xiàn)運動遲緩，肢角擺動頻率下降，趨光性變?nèi)醯默F(xiàn)象[5]；而三氯甲烷同樣使鹵蟲運動減緩，并且極大縮短了從沉入水底到死亡的時間，一旦沉入水底很快死亡。對比其他有機溶劑如丙酮和二甲基亞砜[6]，三氯甲烷對鹵蟲作用明顯，或許是因為其對神經(jīng)系統(tǒng)有麻醉作用的結(jié)果。但具體機理如何，尚未見明確報道。本試驗采取的死亡判定方法為觀察鹵蟲附肢10 s內(nèi)不動即為死亡，與鹵蟲上述中毒特點相符，也符合水生生物急性毒性試驗的質(zhì)量控制要求，使得試驗更加簡單易行。這一點與有些報道所采用的針刺的方法有所不同[5]。

2.3 急性毒性試驗結(jié)果

對照組死亡率為0，按此結(jié)果采用SPSS19.0軟件進行分析，表2為用概率單位法計算24 h和48 h每組試驗數(shù)據(jù)殘差及相應(yīng)的致死概率。其中濃度為取對數(shù)后的結(jié)果。由表2可知，24 h和48 h數(shù)據(jù)中，死亡率小于37%和大于63%均不低于3組，完全符合水生生物急性毒性試驗的質(zhì)量控制要求。

表3為經(jīng)過回歸計算后24 h和48 h各濃度預(yù)測值對應(yīng)的死亡概率及其95%置信限度，為節(jié)省篇幅未全部列出。

表2 單元計數(shù)和殘差Table 2 Cell count and residual

由表2中可以看出，兩個時間組的死亡率均隨濃度增加而上升，但在24 h組中，發(fā)生死亡的濃度范圍較大，即隨濃度的增加死亡率上升較慢；在48 h組中，發(fā)生死亡的濃度范圍相對比較集中，即在該濃度范圍內(nèi)，死亡率隨濃度增加迅速上升，鹵蟲對濃度的變化更為敏感。24 h鹵蟲幼體依靠自身卵黃囊內(nèi)養(yǎng)分生活，一些器官仍處于發(fā)育中；48 h鹵蟲幼體卵黃囊養(yǎng)分已消耗完，開始轉(zhuǎn)向從外部攝取食物。鹵蟲為濾食性動物，因此外部水環(huán)境與身體器官接觸增加，也加劇了三氯甲烷的作用強度，這與本試驗中48 h的LC50低于24 h LC50的結(jié)果相符。

表3 置信限度Table 3 Confidence limits

表 4為軟件計算出的回歸模型，Pearson 擬合度檢驗結(jié)果表明相關(guān)性顯著，所以回歸模型完全符合要求。24 h LC50為59.574 mg?L-1，95%置信限度：55.015～63.380 mg?L-1；48 h LC50為29.139 mg?L-1，95%置信限度：24.051～32.839 mg?L-1。

表4 三氯甲烷對鹵蟲幼體急性毒性效應(yīng)Table 4 The acute toxicity of chloroform on Artemia.francisana

三氯甲烷的毒性研究結(jié)果多見于人和模式動物如小鼠、大鼠[1]，對于水生生物的毒性及危害研究較少。鹵蟲作為受試生物已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于水環(huán)境污染物的毒性評價和生態(tài)毒理學(xué)的研究[7]，如評估鉆井液[8]、重金屬離子[9]、農(nóng)藥[3]等有毒物質(zhì)及某些藻類[10]的生物毒性。有研究表明，三氯甲烷對鹽藻的48 h半數(shù)有效抑制濃度EC50為1.17 μmol?L-1[11]；對斑馬魚的24 h LC50為141 mg?L-1，48 h LC50為129 mg?L-1；濃度為5 mg時可引起大銀魚幼體發(fā)生畸形，畸形率為20%[12]；對水螅的中毒濃度為318 mg?L-1，再生生長抑制濃度為120 mg?L-1[13]。同以上水生生物相比，鹵蟲對三氯甲烷響應(yīng)濃度更低，更適于用來進行生物監(jiān)測。

2.4 試驗的質(zhì)量保證

市售三氯甲烷分析純試劑一般為防止遇光照或與空氣中的氧作用，逐漸分解而生成劇毒的光氣(碳酰氯)和氯化氫，通常加入0.6%～1%的乙醇作為穩(wěn)定劑。為保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確，本試驗中在預(yù)試驗和正式試驗中均采用色譜純?nèi)燃淄?，純度更高，可直接用于試驗而無需再次標(biāo)定。目前一些文獻中的進行的三氯甲烷毒性研究，并未排除乙醇對試驗生物的影響，因此對其毒性的評價與純?nèi)燃淄橄啾仁怯袇^(qū)別的。

本試驗采用 SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，它和SAS、BMDP并稱為國際上最有影響的三大統(tǒng)計軟件。在國際學(xué)術(shù)交流中，凡是用 SPSS軟件完成的計算和統(tǒng)計分析，可以不必說明算法，其統(tǒng)計結(jié)果被國際同行廣泛認(rèn)可。該軟件能根據(jù)回歸模型，直接計算出從1%至99%各濃度對應(yīng)的響應(yīng)概率，并給出95%置信限度，有利于進行半致死濃度研究。

3 結(jié) 論

三氯甲烷對鹵蟲的24 h LC50為59.574 mg?L-1，95%置信限度：55.015～63.380 mg?L-1；48 h LC50為29.139 mg?L-1，95%置信限度：24.051～32.839 mg?L-1。鹵蟲對三氯甲烷濃度變化敏感，可以用于對其進行生物監(jiān)測。中毒48 h對應(yīng)的死亡濃度范圍小于中毒24 h對應(yīng)濃度范圍，且三氯甲烷中毒癥狀與已報道的一些有機物中毒癥狀有相似之處，具體機理有待進一步研究。

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Study on Acute Toxicity of Chloroform on Artemia.francisana

ZHANG Wen-bo，WU Chuang
（College of Chemistry, Chemical Engineering and Environmental Engineering, Liaoning Shihua University, Liaoning Fushun 113001，China）

For evaluating the toxicity of chloroform on aquatic organism, Artemia.francisana was used as test organism to study the acute toxicity of chloroform by probit method. The results show that, at 25 ℃, the 24 h LC50is 59.574 mg?L-1, and its 95% confidence limit is 55.015～63.380 mg?L-1; the 48 h LC50is 29.139 mg?L-1, and its 95% confidence limit is 24.051～32.839 mg?L-1. The lethal effect of chloroform after 48h culture is more significant than that of 24 h, and the concentration response range is also the same.

Chloroform; Artemia.francisana; Acute toxicity

X 835

A

1671-0460（2015）09-2264-04

2015-08-06

張文博（1994-），男，遼寧沈陽人，研究方向：生物化工。E-mail：zhangwbbio@sina.com。

吳闖（1973-），男，碩士，研究方向：生物工程。E-mail：wuchuang2000@sina.com。