代亮，張志東，田垚，蔣寧，牛遠杰

類器官在前列腺癌相關(guān)研究中的作用探索

代亮，張志東，田垚，蔣寧，牛遠杰△

類器官作為新一代臨床前腫瘤模型，其建立對于揭示腫瘤生物學特性及探索對腫瘤患者有效的治療方法具有重要意義。前列腺來源的類器官臨床前腫瘤模型更是在前列腺腫瘤生物學特性研究和抗腫瘤藥物篩選中發(fā)揮了巨大作用。當前普遍且成熟用于構(gòu)建臨床前前列腺腫瘤模型的方式有2種：一種是前列腺腫瘤細胞株培養(yǎng)，另一種是人源性前列腺腫瘤組織異種移植。這2種模型在前列腺癌基礎研究與抗前列腺腫瘤藥物篩選方面具有很高價值，但仍存在諸多無法回避的問題與劣勢。最新研究構(gòu)建的第三類臨床前腫瘤模型——類器官或可解決當前2種模型所存在的弊端。本文就類器官在前列腺癌相關(guān)研究中作用的研究進展作一綜述。

類器官；前列腺腫瘤；異種移植模型抗腫瘤試驗；綜述；臨床前腫瘤模型；前列腺腫瘤細胞系

前列腺癌是當前男性死亡率第二的腫瘤，據(jù)報道，2013年美國因前列腺癌而死亡的男性達29 720例［1］。對于早期前列腺癌患者，通常采取手術(shù)和放療相結(jié)合的方法。晚期前列腺癌以抗雄激素治療為標準手段，但經(jīng)過一段時間的治療后，大部分患者最終仍會發(fā)展成為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）［2］。為探索前列腺癌的生物學特性及提高其診治水平，學者們通常運用臨床前前列腺腫瘤模型來模擬前列腺癌在人體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展情況，并對體內(nèi)藥物反應進行研究。當前普遍運用的為前列腺腫瘤細胞株培養(yǎng)與人源性前列腺腫瘤組織異種移植2種方式。由于人體內(nèi)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展機制精確復雜、生長環(huán)境因素繁多，致使這2種模型的模仿效果與精準度均不理想。因此，許多在模型中作用明顯的備選藥物并未能應用于臨床，不僅浪費了大量研究資源，而且使患者不能得到最佳的治療［3］。本文旨在探討類器官在前列腺癌相關(guān)研究中的作用。

1 前列腺腫瘤細胞系

前列腺腫瘤細胞系是一種重要的前列腺癌研究模型。1977年來源于前列腺癌腦轉(zhuǎn)移灶所構(gòu)建的DU145細胞株為首支前列腺腫瘤細胞系。當前最常用的前列腺腫瘤細胞系有7種，分別為：DU145、LNCAP、PC3、C42、22RV1、VCap及MDA-PCA，其在研究方面具有同源、易復制、單一培養(yǎng)，幾乎可無限增殖及可應用于包括高通量藥物篩選在內(nèi)的大量實驗等優(yōu)勢［4］。阻礙前列腺腫瘤細胞系更廣泛地應用于前列腺癌研究是其構(gòu)建成功率很低，目前成功構(gòu)建的前列腺腫瘤細胞株不足10種，因此無法代表龐大的臨床疾病譜［5］。加之建立的腫瘤細胞系大多來源于腫瘤的轉(zhuǎn)移灶或進展較快的腫瘤，因此原發(fā)性或進展緩慢的腫瘤無法得以科學準確地認識與研究［6］。體外培養(yǎng)腫瘤細胞往往使得腫瘤的異質(zhì)性和適應性缺失，使其基因表達更接近于正常組織而非腫瘤組織。另外，有研究認為傳統(tǒng)的2D細胞系培養(yǎng)模式無法模擬細胞與周圍組織微環(huán)境之間復雜的相互作用［7］。為解決腫瘤生長微環(huán)境問題，有研究將人類腫瘤細胞進行體外培養(yǎng)，篩選出穩(wěn)定的細胞株并注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，用以模仿人體內(nèi)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，但因腫瘤細胞株在體外培養(yǎng)傳代若干次，使得其只是適應外界培養(yǎng)皿的條件，而注入小鼠體內(nèi)后，腫瘤則表現(xiàn)出與小鼠的同質(zhì)性，丟失了原代腫瘤的特性，不能客觀準確反映腫瘤的真實發(fā)生發(fā)展進程，研究效果并不讓人滿意［8］。

2 人源性腫瘤組織異種移植

人源性腫瘤組織異種移植（patient derived tumor xeno?grafts，PDTX）是通過將切下的新鮮腫瘤組織直接種植于免疫缺陷鼠的皮下、原位或腎被膜下而構(gòu)成。隨著PDTX的增長，可以將其連續(xù)植入多個動物體內(nèi)。同時，PDTX保持了原代腫瘤和周圍基質(zhì)結(jié)構(gòu)，能更加準確地反映出腫瘤細胞與周圍環(huán)境的相互作用。研究認為，PDTX的構(gòu)建成功率較腫瘤細胞系的培養(yǎng)成功率要高得多，且不易發(fā)生基因突變［9］。現(xiàn)已有多種生物學性質(zhì)穩(wěn)定的原發(fā)性腫瘤PDTX構(gòu)建成功，并證實為較有效的臨床前模型。雖然PDTX已經(jīng)解決了腫瘤細胞系所不能滿足的諸多研究需求問題，但其仍有一些不足：（1）建立連續(xù)傳代的PDTX成功率很低，且對于人源性腫瘤組織有很高的要求［10］。（2）PDTX與親代腫瘤是否具有相似性必須經(jīng)過復雜嚴格的測定［11］。（3）人源腫瘤和移植受體之間的配體受體關(guān)系并不完全吻合，如HGF-MET［12］。（4）應用動物進行實驗費時費力。因此，針對相應信號通路的研究設想及藥物篩選并不能完全適用于臨床。利用原代腫瘤建立的前列腺類器官體外培養(yǎng)模型可成功結(jié)合前列腺腫瘤細胞系和PDTX的優(yōu)點，為前列腺癌的研究提供了新的工具。

3 前列腺類器官

類器官（organoid）是將具有干性潛能的細胞包被于人工基底膜（matrigel）中進行3D培養(yǎng)，從而形成相應器官來源的上皮結(jié)構(gòu)。作為2013年《科學》十大發(fā)現(xiàn)之一的類器官能準確模擬體內(nèi)上皮結(jié)構(gòu)并能長期傳代培養(yǎng)［13］。目前已經(jīng)成功建立了鼠小腸［14］、胃［15］、肝臟［16］、胰腺［17］、結(jié)腸［18］、前列腺［19-20］類器官，人小腸、結(jié)腸［18］、大腦［21］、肝臟［22］、腎臟［23］、前列腺［19-20］的類器官。這些類器官均能進行長期培養(yǎng)，且具有穩(wěn)定的表型和遺傳學特征。

前列腺類器官作為一種新型且能夠在體外進行長期培養(yǎng)的前列腺癌研究模型，呈球形囊狀微結(jié)構(gòu)，并與體內(nèi)前列腺腺泡結(jié)構(gòu)相似，包含分化的基底（basal）和管腔（luminal）細胞層［24］。目前已經(jīng)建立的前列腺類器官模型包括鼠前列腺組織、單個的luminal和basal細胞、人正常前列腺組織［19］、前列腺癌患者轉(zhuǎn)移灶病理標本以及CRPC患者的循環(huán)腫瘤細胞來源的類器官［20］，且能連續(xù)培養(yǎng)1年以上穩(wěn)定傳代并保持穩(wěn)定的表型［19-20］。

3.1 前列腺類器官模擬體內(nèi)前列腺組織前列腺類器官廣泛的應用前景在于其能在體外準確模擬體內(nèi)前列腺組織。通過HE染色可見前列腺類器官表現(xiàn)為類似于體內(nèi)前列腺的腺腔結(jié)構(gòu)；免疫組化分析可見前列腺腺體典型的腺泡樣結(jié)構(gòu)，basal層（外層）能特異性表達前列腺basal標志物——CK5和p63，luminal層（內(nèi)層）則特異性表達luminal標志物——CK8，且與體內(nèi)前列腺腺腔結(jié)構(gòu)相吻合［19］。

經(jīng)過長期培養(yǎng)的前列腺類器官遺傳學穩(wěn)定性良好，通過基因測序轉(zhuǎn)移灶樣本和相關(guān)來源類器官顯示，每個類器官與其來源的患者基因完全一致［20］。CRPC患者的循環(huán)腫瘤細胞來源的7種類器官細胞系表現(xiàn)出了前列腺癌相關(guān)的遺傳學改變，包括TMPRSS2–ERG染色體融合，DNA修復與染色體調(diào)節(jié)通路突變；SPOP、FOXA1、PIK3R1突變，SPINK1過表達，CHD1、PTEN、p53基因缺失，RB腫瘤抑制通路缺失等［20］。在功能上，正常的前列腺類器官表現(xiàn)出正常的雄激素受體（AR）水平且具有完整的AR信號通路［19］。不同來源的前列腺癌組織培養(yǎng)出的類器官能表現(xiàn)出其相對的AR活性，并在藥物作用下表現(xiàn)出相應變化［20］。

3.2 前列腺類器官的培養(yǎng)條件及探索前列腺類器官成功培養(yǎng)的關(guān)鍵是：在無基質(zhì)條件下，用人工培養(yǎng)液對細胞進行體外3D培養(yǎng)。Sato等［14］通過模擬小腸干細胞的培養(yǎng)環(huán)境成功培養(yǎng)出了小腸類器官，并摸索建立了類器官培養(yǎng)的通用培養(yǎng)基（ENR），包括：細胞分裂素（EGF），Noggin（抑制BMP信號通路），R-spondin-1（促進Wnt信號通路），Matrigel（基底膜代替物）。鼠前列腺的培養(yǎng)以ENR為基礎，需要添加額外生長因子，包括DHT和Alk3/4/5抑制劑A83-01，其中A83-01通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β信號通路來抑制前列腺細胞的增殖［25-26］。Noggin與R-spondin-1能提高類器官培養(yǎng)形成率，同時加快其生長速度，DHT則可以顯著提高類器官的形成率，而EGF對于類器官的建立和傳代都是必需的［19］。

人前列腺類器官的培養(yǎng)在此基礎上（ENR+A83-01+ DHT）需要添加額外的生長因子：纖維母細胞生長因子（FGF）-10、FGF-2、前列腺素E2（PGE2）、煙堿及p38激酶抑制劑SB202190。其中EGF、FGF-2、煙堿、PGE2及A83-01可促進類器官的生長，而移除SB202190會出現(xiàn)類器官組織角質(zhì)化，移除FGF-10、Noggin或R-spondin-1后類器官形成率顯著降低，但傳代不受影響，且上述任何一種生長因子的缺失都會降低AR的表達水平，特別是移除R-spondin-1或Noggin后AR表達徹底喪失，移除EGF后AR的mRNA表達、蛋白表達及AR靶基因PSA會輕度上調(diào)［19-20］。

3.3 前列腺類器官應用及展望

3.3.1 前列腺上皮細胞干性研究前列腺上皮細胞中干祖細胞一直是前列腺癌研究的熱點之一。經(jīng)典的去勢與體外雄激素替代實驗表明，前列腺上皮中存在具有再生能力的前列腺干祖細胞，這些細胞可能在前列腺癌的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，研究其特征對于了解前列腺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要意義［27］。

前列腺導管上皮主要由basal細胞、luminal細胞和少量神經(jīng)內(nèi)分泌細胞3種細胞構(gòu)成［28］。究竟哪種細胞具有干性及3種細胞的分化機制尚不明確。傳統(tǒng)胚胎尿生殖竇間質(zhì)（UGSM）組織重組實驗發(fā)現(xiàn)，basal細胞具有雙重潛能［29］。近幾年利用轉(zhuǎn)基因鼠通過譜系追蹤發(fā)現(xiàn)，前列腺Ck5+basal和Ck8+luminal都具有干細胞活性［30-31］。Wang等［32］研究顯示，在前列腺中存在少量多種潛能的basal細胞。另有研究顯示，鼠castration-resistant Nkx3.1+luminal cell（CARN）亦具有多種潛能［33］。

作為研究前列腺上皮細胞干性的一種新的研究模型，前列腺類器官則通過流式分選挑出單個basal和luminal細胞，分別體外培養(yǎng)形成具有類前列腺腺腔結(jié)構(gòu)的類器官，免疫組化及免疫熒光等實驗表明，basal和luminal細胞中均存在多種潛能祖細胞［19］。前列腺類器官模型和譜系追蹤技術(shù)相結(jié)合進一步證實了castration-resistant Nkx3.1+luminal cell（CARN）具有多種潛能［34］。

3.3.2 研究前列腺腫瘤基因組學及生物學的重要工具隨著大規(guī)模基因組學研究的開展，大量前列腺癌相關(guān)的基因改變逐漸成為前列腺癌研究的熱點［35-36］。轉(zhuǎn)基因工程鼠模型作為研究前列腺腫瘤基因組學和生物學的重要工具，因耗時和價格昂貴，其應用受到了很大限制。前列腺類器官體外研究模型的成功建立為前列腺癌的相關(guān)研究提供了新的可行工具。

研究表明，常用的前列腺癌轉(zhuǎn)基因工程鼠來源的類器官模型在組織學上與轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)表現(xiàn)完全吻合，如PbCre PtenloxP/loxP（敲除Pten基因）前列腺類器官在組織學上表現(xiàn)為高級別上皮內(nèi)瘤變；PbCre Rosa26LSL-ERG（過表達ERG）前列腺類器官在組織學上則表現(xiàn)為正常管腔結(jié)構(gòu)；PbCre PtenloxP/loxPRosa26LSL-ERG（同時敲除Pten基因和過表達ERG）前列腺類器官則可見許多指狀突觸伸入matrigel，提示其具有侵襲性，均良好吻合了之前的體內(nèi)實驗［37］。上述研究表明，體外培養(yǎng)的前列腺類器官在表型上的確能夠模擬體內(nèi)情況。同時，前列腺類器官能夠在體外進行慢病毒［19］與CRISPR/Cas9系統(tǒng)［38］的基因編輯，從而在研究前列腺癌相關(guān)基因方面發(fā)揮巨大作用。由此可見，前列腺類器官體外研究模型既具有轉(zhuǎn)基因工程鼠的組織學表型，又具備體外細胞系能夠長期培養(yǎng)的特性，且具有能夠體外進行基因編輯的特點，因此必將成為研究前列腺腫瘤基因組學及生物學的重要工具。

3.3.3 前列腺癌藥理學研究的重要工具抗雄激素藥物恩雜魯胺和雄激素合成抑制劑——醋酸阿比特龍為新一代前列腺癌治療藥物，已經(jīng)成為治療晚期前列腺癌的標準治療手段［39］，而且2種藥物都能顯著延長前列腺癌患者生存期［40-41］。然而他們的治療效果非常不穩(wěn)定，僅有30%的患者治療效果可持續(xù)6個月以上［42］。因此亟需新的研究手段用于藥物的研發(fā)與篩選。目前廣泛應用于藥物研發(fā)的體外細胞系2D培養(yǎng)系統(tǒng)簡單、經(jīng)濟、重復性好，但現(xiàn)僅有的前列腺癌細胞系無法代表龐大的臨床疾病譜，而且細胞的生長會受到基質(zhì)和支持組織等周圍微環(huán)境的影響［43］。這種單一的培養(yǎng)模式與體內(nèi)的真實環(huán)境相差甚遠，成為高通量藥物篩選的主要障礙。其他的體外研究模型包括PDTX和基因工程鼠模型，由于價格昂貴、費時、無法快速有效地進行大規(guī)模藥物篩選以及鼠的個體差異均會影響藥物干預的結(jié)果分析等，因此無法大規(guī)模推廣［44］。

Gao等［20］體外建立了7種晚期前列腺癌患者來源的類器官，觀察其對抗恩雜魯胺和醋酸阿比特龍的敏感度，證實其治療效果與體內(nèi)試驗完全吻合；其中一株類器官來源于晚期前列腺癌患者循環(huán)腫瘤細胞（CTCs），因此有望僅憑患者少量血液，而無需經(jīng)過復雜且有創(chuàng)的組織活檢即可建立患者特異性的類器官模型。近年來CTCs常被用于乳腺癌的藥物篩選，表明CTCs在高級實體腫瘤診斷中的可行性和巨大應用前景［45］。同時Dekkers等［46］利用類器官建立了用于研究不同個體藥代動力學差異的藥理學研究模型。因此，直接采集前列腺癌患者血液中的CTCs用于體外培養(yǎng)類器官，依托其遺傳學穩(wěn)定的特點，建立不同患者的腫瘤細胞類器官庫，從而對不同患者可進行高通量體外藥物篩選。通過體外藥物篩選，既能發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點，又能針對不同個體的遺傳學改變選擇特異的靶向治療藥物，并利用類器官藥理學研究模型檢測患者藥代動力學特征，合理安排藥物劑量，從而實現(xiàn)個體化醫(yī)療。最終目標是針對不同個體進行特異性治療，從而大大改善前列腺癌患者的預后，提高生存率。

此外，前列腺類器官在基因治療方面也表現(xiàn)出廣泛的應用前景。雖然當前關(guān)于前列腺癌類器官干細胞治療尚少見報道，但Schwank等［38］利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，將修復片段整合入囊性纖維化患者來源的類器官，糾正了類器官的突變表型。Yui等［47］將體外培養(yǎng)的干細胞來源的結(jié)腸上皮類器官移植入損傷的小鼠結(jié)腸上皮，并成功修復了損傷的結(jié)腸上皮。這些研究成果展現(xiàn)出了類器官用于基因治療的巨大潛力，引發(fā)了將前列腺癌類器官通過體外基因修復實現(xiàn)體內(nèi)組織學修復的思考。

綜上所述，類器官作為一種新型的前列腺腫瘤體外研究模型，既能準確模擬體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)及生理學過程，又能連續(xù)傳代并進行基因修飾。雖然當前類器官培養(yǎng)技術(shù)相對困難，但相信在不久的將來定能成為前列腺腫瘤機制研究、藥物研發(fā)及臨床指導不可或缺的工具。

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（2015-02-13收稿2015-03-17修回）

（本文編輯陸榮展）

Role of organoid in prostate cancer research

DAI Liang，ZHANG Zhidong，TIAN Yao，JIANG Ning，NIU Yuanjie△
Tianjin Institute of Urology；Tianjin Key Laboratory of Urology；The Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China△

As a new model of pre-cancer，organoid is essential for the basic understanding of tumor characteristic and effective tumor treatment.Organoids derived from prostate play an especially important role in the research of fundamental oncology and anticancer drug screen against prostate cancer.Prostate cancer cell lines and xenografts derived directly from primary human tumors are widely used now as models to study prostate cancer and have proven very valuable.But there are some caveats and shortcomes of these two models that have to be accounted for.Here we outline organoid as a third preclini?cal cancer model which may potentially overcome the shortcomes of cancer cell lines and PDTX.This article aims to summa?rizee recent progress of the role of organoid in prostate cancer research.

organoid；prostatic neoplasms；X enograft model antitumor assays；review；reclinical model；prostate can?cer cell lines

R318.16

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.032

天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院；天津市泌尿外科基礎醫(yī)學重點實驗室；天津市泌尿外科研究所（郵編300211）

代亮（1990），男，碩士在讀，主要從事前列腺癌相關(guān)方面研究

△通訊作者E-mail：niuyuanjie9317@sina.com