吳麗華, 陳燕飛, 陳 鵬

(太原師范學(xué)院 生物系,太原 030031)

硫酸鋅對蠶豆根尖細胞的遺傳損傷效應(yīng)

吳麗華, 陳燕飛, 陳 鵬

(太原師范學(xué)院 生物系,太原 030031)

以蠶豆根尖細胞為實驗材料,研究不同質(zhì)量濃度的硫酸鋅(ZnSO4,100～600 mg/L)對植物細胞的毒性效應(yīng).研究結(jié)果顯示,在0～600 mg/L范圍內(nèi),ZnSO4可誘導(dǎo)蠶豆根尖細胞內(nèi)ROS水平升高,誘發(fā)細胞遺傳損傷,使分裂指數(shù)下降、微核率增加,且隨著濃度的升高毒性增強，在一定濃度范圍內(nèi)(0～500 mg/L),細胞微核率與處理濃度呈正相關(guān)(P<0.01).一定濃度的生育酚(VE)、抗壞血酸(AsA)或甘露醇(MT)與ZnSO4共同作用時,胞內(nèi)ROS水平下降,分裂指數(shù)升高,微核率降低.研究結(jié)果提示,鋅可誘導(dǎo)蠶豆跟腱細胞發(fā)生遺傳損傷,并且與胞內(nèi)ROS水平升高有關(guān).

蠶豆;ZnSO4;微核;分裂指數(shù);ROS

鋅作為生物體的必需元素之一,是300多種酶的輔助因子[1],對維持生物正常的生長發(fā)育有著十分重要的作用．植物缺鋅時可影響光合作用,導(dǎo)致生長發(fā)育緩慢,作物產(chǎn)量下降[2]．因而,市場上出現(xiàn)了大量含鋅農(nóng)藥,以期提高農(nóng)作物的產(chǎn)量．然而,高濃度的鋅也會對生物造成傷害．研究表明,一定濃度的鋅可引起植物細胞氧化損傷和遺傳損傷[3,4]．因此,鋅毒害開始受到關(guān)注．

植物根尖微核技術(shù)具有靈敏、簡便、快速,并且其檢測結(jié)果與動物實驗具有高度一致性,已被世界多個組織采納并廣泛用于環(huán)境毒物檢測中[5,6]．蠶豆根尖微核實驗是常用的植物檢測方法,可用來檢測環(huán)境毒物的遺傳毒性．本文運用蠶豆根尖微核實驗,研究鋅化物的遺傳毒性機理,以期為研究抗逆機理提供實驗依據(jù)．

1 材料與方法

1.1實驗材料

選取籽粒飽滿、大小一致的蠶豆種子浸種36 h后用濕紗布包裹催芽24 h．將萌發(fā)的蠶豆放入墊有濕脫脂棉的培養(yǎng)皿中,室溫條件培養(yǎng);待根長約2 cm時去其根尖,促其側(cè)根生長．

1.2材料處理

選取生長一致的蠶豆幼苗隨機分組,并用質(zhì)量濃度分別為100 mg/L，200 mg/L，300 mg/L，400 mg/L，500 mg/L 和600 mg/L的ZnSO4溶液培養(yǎng);對照組用自來水培養(yǎng);緩解組采用1 mg/L VE，1 mg/L AsA或0.1 mg/L MT分別與500 mg/L的ZnSO4同時培養(yǎng)．染毒12 h,換用蒸餾水培養(yǎng)24 h后,用于毒性實驗．

1.3指標測定

1.3.1分裂指數(shù)和微核率檢測

切取蠶豆根尖,用卡諾氏固定液固定24 h后,轉(zhuǎn)入70%乙醇中4 ℃保存．用孚爾根法將根尖細胞染色后,切取分生區(qū)1 mm置于載玻片上,常規(guī)壓片．在顯微鏡下直接觀察并統(tǒng)計微核細胞、分裂細胞和分生區(qū)細胞數(shù)目．每個處理觀察5個根尖, 每個根尖計數(shù)分散良好的細胞約1 000 個．微核率=微核數(shù)/觀察細胞數(shù)×1 000‰,細胞有絲分裂指數(shù)=有絲分裂細胞數(shù)/觀察細胞總數(shù)×100%．

1.3.2胞內(nèi)ROS檢測

藥物處理后,取蠶豆根尖細胞于20 μmol·L-1的ROS熒光指示劑2,7-二氯熒光黃雙乙酸酯(2,7-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)溶液中室溫下暗孵育 30 min,用PBS洗滌后,切取根尖1～1.5 mm置于載玻片上,常規(guī)壓片．在熒光顯微鏡下觀察并拍照(激發(fā)波長488 nm)．

1.4數(shù)據(jù)分析

計算每組重復(fù)實驗的平均值和標準差,F檢驗后,采用Duncan方法進行比較,分析處理組與對照組之間的差異顯著性(*P<0.05,差異顯著;**P<0.01,差異極顯著)．

2 結(jié)果與分析

2.1硫酸鋅對蠶豆根尖細胞分裂指數(shù)的影響

硫酸鋅對蠶豆根尖細胞分裂指數(shù)的影響如圖1所示．從圖中可以看出,硫酸鋅可抑制蠶豆根尖細胞有絲分裂．隨著處理濃度的增高,分裂指數(shù)逐漸下降．當硫酸鋅濃度為600 mg/L時,分裂指數(shù)顯著降低,分裂指數(shù)為對照組的46.67%．

2.2硫酸鋅對蠶豆根尖細胞微核率的影響

從圖2可以看出,硫酸鋅可誘導(dǎo)蠶豆根尖細胞微核的形成．在一定濃度范圍內(nèi)(0～500 mg/L),隨著處理濃度的增加,細胞微核率逐漸增加,具有一定的濃度依賴性．在500 mg/L處理組中,細胞微核為20 ‰,為對照組的14.29 %,與對照組具有極顯著差異;而在600 mg/L處理組中,細胞微核率有所下降,但仍顯著高于對照組．

2.3抗氧化劑對硫酸鋅致蠶豆根尖細胞遺傳損傷的緩解作用

從圖3可以看出,對照組細胞具微弱的熒光,而處理組中細胞熒光明顯增強,說明硫酸鋅可誘導(dǎo)蠶豆根尖細胞內(nèi)ROS水平增高．加入1 mg/L VE,1 mg/L AsA或0.1 mg/L MT與ZnSO4同時作用時,細胞熒光強度明顯弱于鋅單獨處理組(圖3),且硫酸鋅引起的遺傳損傷得到明顯的緩解(圖4)．結(jié)果表明,硫酸鋅引起細胞遺傳損傷與胞內(nèi)ROS水平的升高有關(guān),即ROS參與了硫酸鋅引起的遺傳損傷過程．

3 討論

鋅是生物生長的必需微量元素之一,缺鋅時可導(dǎo)致DNA受損,細胞有絲分裂受阻,機體生理功能下降[7,8]．但是,鋅濃度過高同樣會對機體產(chǎn)生不利影響．李小玲發(fā)現(xiàn),鋅過量與鋅缺乏一樣,均具有一定的胚胎毒性,能影響小鼠胚胎的生長發(fā)育,并誘發(fā)多種畸形[9]．此外,高濃度的鋅可抑制生物正常生長,降低體內(nèi)

抗氧化酶活性,嚴重時導(dǎo)致細胞死亡[3,4, 10-13]．本實驗以蠶豆根尖細胞為材料研究了鋅對植物細胞的毒性作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當蠶豆幼苗經(jīng)高濃度鋅脅迫后,根尖細胞微核率升高,分裂指數(shù)下降,即一定濃度的鋅對植物細胞具有遺傳毒性．

ROS是細胞在有氧代謝過程中一部分氧不能被完全還原而生成的產(chǎn)物,可以與細胞中各類大分子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),從而破壞細胞結(jié)構(gòu),影響細胞的正常功能．當鋅濃度過高時,蠶豆根尖細胞內(nèi)ROS水平升高．外源ROS清除劑VE,ASA和MT,可以通過直接清除或間接的酶促反應(yīng)來調(diào)節(jié)體內(nèi)ROS水平來提高生物對環(huán)境脅迫的耐受性．當一定濃度的VE、ASA或MT與ZnSO4共同作用時,蠶豆根尖細胞內(nèi)ROS水平下降,鋅引起的遺傳損傷毒性也得到明顯的緩解．據(jù)此推測,硫酸鋅對植物根尖細胞的毒性與胞內(nèi)ROS水平的升高．

經(jīng)鋅脅迫后,胞內(nèi)ROS水平顯著升高,而較高濃度的ROS可激活其抗氧化系統(tǒng)并使細胞分裂延遲[14,15],導(dǎo)致細胞分裂指數(shù)下降;ROS可攻擊DNA中的嘌呤、嘧啶和脫氧核糖,使DNA損傷;ROS還能影響細胞的DNA合成功能,改變DNA修復(fù)機制,使染色體發(fā)生畸變,誘導(dǎo)微核生成[6,14]．當鋅濃度過高時,微核率下降,這是因為較高濃度的鋅對細胞毒性較大,使植物根尖部分細胞發(fā)生核固縮,根尖中參與分裂的細胞數(shù)目減少;而損傷的DNA在不能分裂的細胞中無法形成微核,因此,根尖微核率降低[15]．

4 結(jié)論

本文采用蠶豆根尖細胞研究鋅化物的毒性效應(yīng),發(fā)現(xiàn)一定濃度的鋅對植物根尖細胞具有遺傳毒性,可誘導(dǎo)蠶豆根尖細胞微核率升高,分裂指數(shù)下降,且鋅對植物根尖細胞的毒性與胞內(nèi)ROS水平有關(guān)．

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Genotoxicity of Zinc Sulfate on the Root Tip Cells of Vicia Faba

WU Lihua, CHEN Yanfei, CHEN Peng

(Department of Biology, Taiyuan Normal University, Taiyuan 030031, China)

Zinc is an essential trace element and has important biological functions. However,excessive intake of zinc supplements is also a potential risk to humans. In this study, toxic effects of zinc on broad bean(vicia faba) were investigated either alone or in combination with some antagonists. For zinc treatment, broad bean seedling incubated in the solution containing varying amounts of zinc sulfate. For other combination treatment, selected antioxidant substances including ascorbic acid(AsA), mannitol(MT) and tocopherol(VE) were respectively added into the solution in the presence of 500 mg/L zinc sulfate. Present results showed that mitotic index(MI) decreased, but the micronuclei(MN) frequency increased significantly in vicia faba root tips after exposure to the zinc sulfate at the concentrations of 100～600 mg/L for 12 h. Moreover, zinc sulfate exposure also induced an obvious increase of intracellular ROS levels. However, when either antioxidant substances AsA (1 mg/L), MT(0.1 mg/L)or VE(1 mg/L) was used to block intracellular ROS increase,zinc sulfate-induced MN frequency significantly decreased and MI increased. These results suggested that zinc was genotoxic when the treatment concentration was higher, which is associated with an increase of the intracellular ROS levels.

vicia faba; zinc sulfata; micronuclei; mitotic index; ROS

2015-07-18

基本項目：國家自然科學(xué)基金項目(21307087);山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(2015363).

吳麗華(1981-),女,山西交口人,博士,太原師范學(xué)院生物系副教授,主要從事環(huán)境毒理學(xué)方面的研究.

1672-2027(2015)03-0081-04

X832

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