田 嬌,吳 洋,劉 園,黨悅方,岳 明,房敏峰

(西北大學(xué) 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安 710069)

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·生命科學(xué)·

光照強(qiáng)度對(duì)遠(yuǎn)志生長(zhǎng)及口山酮類(lèi)成分積累的影響

田 嬌,吳 洋,劉 園,黨悅方,岳 明,房敏峰

(西北大學(xué) 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安 710069)

建立遠(yuǎn)志口山酮類(lèi)成分含量測(cè)定方法,考察光照強(qiáng)度對(duì)遠(yuǎn)志生長(zhǎng)發(fā)育及口山酮類(lèi)成分積累的影響。方法:待遠(yuǎn)志幼苗生長(zhǎng)至8-10片真葉時(shí),采用市售遮陰網(wǎng)分3組處理,包括自然光照組、單層遮陰網(wǎng)組(30%自然光照)和雙層遮陰網(wǎng)組(10%自然光照),處理后第15 d，30 d和60 d分別采樣測(cè)定口山酮類(lèi)成分含量及相關(guān)生理指標(biāo),GraphPad Prism 5 和SPSS17.0軟件作圖分析。結(jié)果:短期遮陰能提高遠(yuǎn)志根部口山酮類(lèi)成分和地上總黃酮含量,但長(zhǎng)期遮陰后,遠(yuǎn)志根部口山酮類(lèi)含量和產(chǎn)量均受到抑制;長(zhǎng)期遮陰后葉面積和地上部分干重顯著升高(P<0.05),而根干重顯著下降(P<0.05)。強(qiáng)光照能提高遠(yuǎn)志藥用部位口山酮類(lèi)含量和產(chǎn)量,而遮陰能提高地上部分芒果苷含量。

口山酮;遠(yuǎn)志;光照強(qiáng)度

光照強(qiáng)度對(duì)植物次生代謝物含量影響顯著,尤其是黃酮類(lèi)成分[1-3]。不同植物中黃酮的合成和積累對(duì)光照強(qiáng)度的需求不一致,因此根據(jù)植物的需求來(lái)調(diào)整光強(qiáng),可改變其黃酮含量。遠(yuǎn)志PolygalatenuifoliaWilld.為喜光植物,體內(nèi)含有一類(lèi)結(jié)構(gòu)特殊的黃酮類(lèi)成分—口山酮,基本母核由苯環(huán)與色原酮的2，3位駢合而成,又稱(chēng)苯并吡酮類(lèi)。迄今在遠(yuǎn)志中發(fā)現(xiàn)30多種口山酮類(lèi)成分,具有止痛、抗菌、抗抑郁等活性[4],其代表性成分遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ或芒果苷的HPLC測(cè)定方法也見(jiàn)報(bào)道[5-6],但光照強(qiáng)度對(duì)遠(yuǎn)志口山酮類(lèi)成分的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本文考察了光照強(qiáng)度對(duì)遠(yuǎn)志生理生化及口山酮類(lèi)成分的影響,以期為遠(yuǎn)志的人工栽培提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 植物材料

遠(yuǎn)志種子購(gòu)于陜西合陽(yáng)縣水車(chē)頭村,經(jīng)西安市食品藥品檢驗(yàn)所謝志民研究員鑒定為合陽(yáng)栽培遠(yuǎn)志PolygalatenuifoliaWilld.的3年生種子,貯存于干燥通風(fēng)處,測(cè)得發(fā)芽率為82 %。

1.2 儀器和試劑

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司);U-3310紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本日立公司);DZF-6050型真空干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);TGL-16G高速離心機(jī)(上海安寧科學(xué)儀器公司);USB4000-UV-VIS Ocean Optics 光纖光譜儀(美國(guó)海洋光學(xué)公司)。

遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ對(duì)照品(批號(hào):ps10091301,購(gòu)自成都普思生物科技有限公司);芒果苷對(duì)照品(批號(hào):111607-200402,購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所);乙腈、甲醇(色譜純,美國(guó)Fisher公司);蒸餾水;其他試劑均為分析純。

2 方 法

遠(yuǎn)志種子直播于聚乙烯塑料盆中,待幼苗生長(zhǎng)至8-10片真葉時(shí),采用市售遮陰網(wǎng)分3組處理,包括自然光照組、單層遮陰網(wǎng)組(30%自然光照)和雙層遮陰網(wǎng)組(10%自然光照),每組10盆,處理后第15 d、30 d和60 d分別采集樣品,80℃烘干,用于口山酮類(lèi)成分含量測(cè)定。處理60 d時(shí),隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株進(jìn)行葉面積和生物量測(cè)定。

2.1 遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ和芒果苷的含量測(cè)定

色譜條件:色譜柱為GL Inertsil ODS-SP C18(4.6 mm×250 mm, 5μm);流動(dòng)相為乙腈(0.03%磷酸)-水(0.03%磷酸)系統(tǒng),洗脫條件為:0～13 min:18%乙腈;13～28 min:26%乙腈;28～46 min:32%乙腈;46～52 min:60%乙腈;檢測(cè)波長(zhǎng):320 nm;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:30 ℃;流速:0.8 mL/min。以峰面積為縱坐標(biāo),對(duì)照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),得遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ回歸方程為Y=3E+07X-20 510,R2=0.999 7,表明遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ在0.005～1.000 mg/mL線(xiàn)性關(guān)系良好;芒果苷回歸方程為Y=28 717X+15 730,R2=0.999 7,表明芒果苷在0.9～360 μg/mL線(xiàn)性關(guān)系良好。精密稱(chēng)取遠(yuǎn)志根部、地上部分樣品粉末各0.1 g,加40倍量60%(體積分?jǐn)?shù))甲醇超聲提取45 min,離心,取上清液定容至3 mL,即為供試品溶液,取樣品溶液10 μL進(jìn)樣,根據(jù)回歸方程計(jì)算含量。測(cè)定結(jié)果如圖1所示。

2.2 遠(yuǎn)志總黃酮含量測(cè)定

采用Al(NO3)3顯色法測(cè)定遠(yuǎn)志總黃酮含量。以吸光度為縱坐標(biāo),對(duì)照品溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),得遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ回歸方程為Y=21.311X-0.006 4,R2=0.999 1,表明遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ在0.0～0.04 mg/mL線(xiàn)性關(guān)系良好;芒果苷回歸方程為Y=43.347X-0.006 5,R2=0.999 0,表明芒果苷在0.0～0.02 mg/mL線(xiàn)性關(guān)系良好。分別精密吸取適量的遠(yuǎn)志根部和地上樣品溶液,60%(體積分?jǐn)?shù))甲醇定容至2.0 mL,并加入0.5 mL 10%(體積分?jǐn)?shù))Al(NO3)3,40 ℃顯色10 min后,60%(體積分?jǐn)?shù))甲醇定容至6.0 mL,搖勻,分別在400 nm和415 nm測(cè)定吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算總黃酮含量。

圖1 遠(yuǎn)志根部、地上樣品提取液的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of extract in the root and shoot of Polygala tenuifolia Willd.

3 結(jié)果與分析

3.1 光照強(qiáng)度對(duì)遠(yuǎn)志葉面積及生物量的影響

隨機(jī)采集3組遠(yuǎn)志植株頂端葉片各45片,計(jì)算各組面積。如圖2所示。

圖2 光照強(qiáng)度對(duì)遠(yuǎn)志幼苗葉面積和生物量的影響Fig. 2 Effect of light intensity on leaf area and mass of seedlings of Polygala tenuifolia Willd.

由圖2可見(jiàn),隨光照強(qiáng)度減弱,葉面積和地上部分干重增加,但根部干重和總生物量降低。提示長(zhǎng)期遮陰后,植株生物量分配更趨于地上部分,降低了藥用部位(根)的產(chǎn)量。

3.2 光照強(qiáng)度對(duì)遠(yuǎn)志口山酮類(lèi)成分含量的影響

黃酮類(lèi)是植物抗氧化抗腫瘤活性成分。遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ是遠(yuǎn)志根部口山酮的代表性成分,地上部分則為芒果苷,口山酮Ⅲ含量極微。光強(qiáng)對(duì)其影響見(jiàn)表1。

表1可見(jiàn),短期遮陰(15d)能同時(shí)提高遠(yuǎn)志根部總黃酮及口山酮Ⅲ含量(P<0.05),降低地上部分總黃酮含量(P<0.05);長(zhǎng)期遮陰(60d)根部總黃酮含量幾無(wú)變化(P<0.05),但根部口山酮Ⅲ含量顯著下降(P<0.05),地上芒果苷含量顯著升高(P<0.05)。

表1 光照強(qiáng)度對(duì)遠(yuǎn)志口山酮類(lèi)成分含量的影響Tab.1 Effect of light intensity on the content of the xanthones in Polygala tenuifolia Willd.

3.3 光照強(qiáng)度對(duì)遠(yuǎn)志口山酮類(lèi)成分產(chǎn)量的影響

遠(yuǎn)志中口山酮類(lèi)成分的產(chǎn)量即口山酮類(lèi)含量與生物量的乘積,見(jiàn)圖3。處理60 d時(shí),隨光照強(qiáng)度減弱,根部總黃酮和遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ產(chǎn)量降低;地上部分芒果苷產(chǎn)量升高,總黃酮在30%自然光照強(qiáng)度下降低,但當(dāng)光照強(qiáng)度降低到10%時(shí),回復(fù)到自然光照水平。提示長(zhǎng)期高度遮陰促進(jìn)地上部分芒果苷產(chǎn)量,抑制根部總黃酮及口山酮Ⅲ產(chǎn)量。

圖3 光照強(qiáng)度對(duì)遠(yuǎn)志口山酮類(lèi)成分產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of light intensity on the production of xanthones in Polygala tenuifolia Willd.

4 討 論

4.1 遠(yuǎn)志總黃酮含量測(cè)定方法的建立

NaNO2-A1(NO3)3-NaOH 比色法是總黃酮測(cè)定的常用方法,但存在一定局限性[7]。口山酮結(jié)構(gòu)特殊,穩(wěn)定性較高,不易開(kāi)環(huán)與堿液反應(yīng),因此,NaNO2-A1(NO3)3-NaOH 比色法不適合遠(yuǎn)志總黃酮的含量測(cè)定,而實(shí)驗(yàn)中采用Al(NO3)3顯色后測(cè)定遠(yuǎn)志總黃酮含量,準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性高。

4.2 光照強(qiáng)度對(duì)遠(yuǎn)志生長(zhǎng)及口山酮類(lèi)含量和產(chǎn)量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,長(zhǎng)期遮陰有利于遠(yuǎn)志地上部分生物量積累,表明遠(yuǎn)志對(duì)蔭蔽環(huán)境有一定的適應(yīng)性,但長(zhǎng)期遮陰不利于遠(yuǎn)志的正常發(fā)育和藥用部位的積累,導(dǎo)致膜質(zhì)過(guò)氧化加劇,嚴(yán)重者還會(huì)導(dǎo)致植株的死亡。短期遮陰對(duì)遠(yuǎn)志中口山酮類(lèi)成分的積累具有促進(jìn)作用,但長(zhǎng)期遮陰后,根部口山酮類(lèi)成分的含量和產(chǎn)量均受到抑制。綜上所述,強(qiáng)光照有利于遠(yuǎn)志的生長(zhǎng)及其藥用部位口山酮類(lèi)成分的合成與積累。

4.3 遠(yuǎn)志地上資源開(kāi)發(fā)探索

本實(shí)驗(yàn)測(cè)得1年生遠(yuǎn)志幼苗地上部分含芒果苷1.02 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),李學(xué)堅(jiān)等[8]報(bào)道了芒果苷在芒果葉、芒果樹(shù)皮和芒果果實(shí)中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.08%，0.38%和2.31%,由于芒果苷具有抗病毒、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[9-10],說(shuō)明遠(yuǎn)志地上部分具有一定的藥用價(jià)值。但是，在實(shí)際生產(chǎn)中,遠(yuǎn)志地上部分常被視為非藥用部位而丟棄,造成大量的資源浪費(fèi)。因此,本研究可以為遠(yuǎn)志資源的綜合開(kāi)發(fā)研究提供思路。

[1] 蘇文華, 張光飛, 李秀華, 等. 光強(qiáng)和光質(zhì)對(duì)燈盞花生長(zhǎng)與總黃酮量影響的研究[J]. 中草藥, 2006, 37(8): 1244-1247.

[2] TATTINI M, GALARDI C, PINELLIP, et al. Differential accumulation of flavonoids and hydroxycinnamates in leaves of Ligustrum vulgare under excess light and drought stress[J]. New Phytologist, 2004, 163(3): 547-561.

[3] 何丙輝, 鐘章成. 不同環(huán)境脅迫下銀杏構(gòu)件種群藥用成分變化的研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 25(1): 7-10.

[4] 楊學(xué)東, 徐麗珍, 楊世林. 遠(yuǎn)志屬植物中口山酮類(lèi)成分及其藥理研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2000, 12: 88-94.

[5] 李云峰, 房敏峰, 張文娟, 等. HPLC指紋圖譜法鑒別遠(yuǎn)志及其偽品[J]. 西北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2008, 38(2): 246-248.

[6] 楊曉娟, 鄒萍萍, 周觀燊, 等. HPLC法測(cè)定白木香葉和遠(yuǎn)志地上部分芒果苷的含量[J]. 藥物分析雜志, 2012, 32(7): 1175-1178.

[7] 郭亞健, 范莉, 王曉強(qiáng), 等. 關(guān)于NaNO2-A1(NO3)3-NaOH比色法測(cè)定總黃酮方法的探討[J]. 藥物分析雜志, 2002, 22(2): 97-99.

[8] 李學(xué)堅(jiān), 鄧家剛. 芒果樹(shù)不同植株部位的芒果苷含量比較[J]. 山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 8(2): 43-44.

[9] ZHAO J, ZHANG B, LI S, et al. Mangiferin increases Nrf2 protein stability by inhibiting its ubiquitination and degradation in human HL60 myeloid leukemia cells[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2014, 33(5): 1348-1354.

[10] KAVITHAM, MANIVASAGAM T, ESSA M M, et al. Mangiferin antagonizes rotenone: Induced apoptosis through attenuating mitochondrial dysfunction and oxidative stress in SK-N-SH neuroblastoma cells[J]. Neurochemical Research, 2014, 39(4): 668-676.

(編 輯陳鐿文)

Effects of light intensity on xanthones accumulation and biomass inPolygalatenuifoliaWilld.

TIAN Jiao, WU Yang, LIU Yuan, DANG Yue-fang, YUE Ming, FANG Min-feng

(Key Laboratory of Resource Biological and Biotechnology in Western China/College of Life Sciences, Northwest University, Xi′an 710069， China)

To establish a method to determine the content of xanthones inPolygalatenuifoliaWilld. and study the effects of light intensity on growth and xanthones accumulation inPolygalatenuifoliaWilld. The seedlings were under different treatments, including natural light group, single shading network group (30% natural light) and double shading network group (10% natural light), collected after 15 d, 30 d and 60 d respectively, then detected the content of xanthones and physiology characteristics inPolygalatenuifoliaWilld.The accumulation of xanthones were improved in the root ofPolygalatenuifoliaWilld. and the total flavonoids in the shoot ofPolygalatenuifoliaWilld. under the short shading condition. But on the long term shading condition, the accumulation and production of xanthones in the root ofPolygalatenuifoliaWilld. were both inhibited. Besides, leaf area and dry weight of the shoot were enhanced significantly under the long term shading condition(P<0.05), but dry weight of the root was reduced significantly(P<0.05). The strong light is conducive to the accumulation of xanthones in the medicinal part ofPolygalatenuifoliaWilld., but shading can enhance the content of mangiferin in the shoot ofPolygalatenuifoliaWilld., which provides reference for the artificial cultivation and the medicinal resources development ofPolygalatenuifoliaWilld.

xanthones;PolygalatenuifoliaWilld.; light intensity

2014-05-11

陜西省科技廳社發(fā)攻關(guān)基金資助項(xiàng)目(2013K14-03-02);陜西省教育廳自然科學(xué)專(zhuān)項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2013JK0808);陜西省中醫(yī)藥管理局專(zhuān)項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(13-ZY052);教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金資助項(xiàng)目(ZS12012)

田嬌,女,陜西西安人,從事中藥生態(tài)化學(xué)研究。

房敏峰,女,陜西商州人，西北大學(xué)教授，從事中藥資源與炮制研究。

R282.2

：ADOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2015-02-018