吳照宇，郭應(yīng)興，雷進(jìn)元，于海東

（青海大學(xué)附屬醫(yī)院介入科，青海西寧 810001）

原發(fā)性肝癌是臨床常見的惡性腫瘤類型之一，我國是世界上肝癌的高發(fā)地區(qū)，每年約有10萬人死于肝癌，僅次于胃癌和肺癌，已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類健康的疾病之一［1］。手術(shù)治療是目前肝癌治療的主要手段，但是約90%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會(huì)，因此化療是這類患者的主要治療方法［2］。其中肝動(dòng)脈插管栓塞化療（TACE）是目前原發(fā)性肝癌的常用治療方法［3-4］。但是近年來化療藥物臨床耐藥性成為TACE治療原發(fā)性腫瘤所面臨的問題。目前，臨床研究顯示多藥耐藥（mutidrug resistance，MDR）是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一。MDR1編碼的P-糖蛋白（P-gp）可將化療藥物從腫瘤細(xì)胞中“泵出”，從而降低了化療藥物的殺傷作用［5-6］。再如，P-gp在乳腺癌、肺癌以及胰腺癌中呈過表達(dá)狀態(tài)，與這些腫瘤的耐藥性密切相關(guān)［7-9］。本研究分析了原發(fā)性肝癌患者中MDR1基因及其編碼的P-gp的表達(dá)變化，并分析了其表達(dá)與TACE化療療效的關(guān)系，旨在為原發(fā)性肝癌臨床化療的治療用藥提供一定的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystem公司；2×SYBR Green通用型qPCR Master Mix購自羅氏生物；鼠抗人P-gp單克隆抗體購自美國Santa公司；羊抗鼠HRP標(biāo)記的二抗購自康為世紀(jì)有限公司；二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒及抗原修復(fù)液購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；蘇木素和中性樹脂購自上海試劑有限公司；其他有機(jī)試劑均購自國藥集團(tuán)，為分析純?cè)噭?/p>

1．2 臨床資料及標(biāo)本采集 選取2010年6月至2013年6月青海大學(xué)附屬醫(yī)院收治的原發(fā)性肝癌108例患者作為研究對(duì)象，所有患者均為經(jīng)B超引導(dǎo)下腫瘤穿刺活檢病理證實(shí)，均符合原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)［10］。108例患者均為初治，其中男69例，女39例；年齡50～65歲，平均年齡（60．41±10．23）歲；臨床分期：Ⅲ期64例，Ⅳ期44例。甲胎蛋白（AFP）≥400μg 50例，AFP≤400μg 58例，HB-sAg 19例；肝功能Child A級(jí)71例，B級(jí)37例；腫瘤位置：左肝40例，右肝68例。

同時(shí)選擇同期來院進(jìn)行肝臟穿刺檢查的50例健康者作為對(duì)照研究，其中男30例，女20例；年齡48～62歲，平均年齡（58．33±10．21）歲。兩組患者在性別和年齡等指標(biāo)的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性（P＞0．05）。

經(jīng)穿刺活檢取得肝組織，分別用于提取基因和蛋白，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1．3 化療方案 所有肝癌組患者均采用TACE方法進(jìn)行化療，采用Seldinger技術(shù)，先注入600g／L泛影葡胺30mL，以確定肝內(nèi)導(dǎo)管位置以及腫瘤血液供應(yīng)情況。然后按照如下方案化療：阿霉素40～60 mg／m2，D1（第1天）；5-氟尿嘧啶400～600mg／m2，D1-4（第1～4天）；順鉑30～40mg／m2。

1．4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝組織中P-gp的mRNA表達(dá) 活檢組織置于1mL Trizol溶液中，勻漿后加入200μL氯仿，震蕩混勻后，冰上放置15min使溶液分層，然后12 000r／min離心15min，將上清轉(zhuǎn)移至500μL的異丙醇中，混勻后再冰上放置15 min，12 000r／min離心10min使 RNA沉淀，然后用預(yù)冷的750mL／L乙醇洗滌2次，最后沉淀溶于DEPC處理的雙蒸水中。測(cè)定樣本濃度，并采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為PCR的模板。

根據(jù)GenBank提供的MDR1mRNA序列，設(shè)計(jì)如下引物：MDR1-F：5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′；MDR1-R：5′-GTTCAAACTTCTGCTCCTCA-3′。β-Actin-F：5′-GCGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，β-Actin-R：5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′。引物稀釋后首先對(duì)引物特異性和退火溫度進(jìn)行條件優(yōu)化。然后按照下述反應(yīng)體系制備反應(yīng)混合物：2×SYBR Green通用型qPCR Master Mix 10μL，上游／下游引物（10μmmol／L）各1μL，cDNA 1μL，補(bǔ)雙蒸水至終體積為20μL。根據(jù)檢測(cè)樣本的數(shù)量配制相應(yīng)的體積，對(duì)應(yīng)加入PCR板中，每孔20μL。1 500r／min離心將反應(yīng)混合物甩至管底，根據(jù)下列反應(yīng)條件進(jìn)行PCR：預(yù)變性95℃30s；變性95℃，3s；退火延伸60℃30s；構(gòu)建溶解曲線。最后從實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上直接讀取數(shù)據(jù)。

1．5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織中P-gp的表達(dá)肝穿刺組織經(jīng)石蠟包埋，連續(xù)切成5μm的薄片，粘附于多聚賴氨酸處理的玻片上，在50℃烘箱中烤1h，依次用二甲苯、梯度乙醇進(jìn)行水化，蒸餾水洗滌3次。然后將玻片置于含檸檬酸鈉的緩沖液中，加熱處理8min，重復(fù)2次，用PBS洗滌3次；滴加30mL／L的過氧化氫（750 mL／L甲醇配制）處理30min去除內(nèi)源性過氧化氫酶。PBS洗滌3次，每次5min。將稀釋的P-gp一抗按比例稀釋滴加后，4℃孵育過夜，經(jīng)PBST洗滌3次×5min；滴加100mL／L山羊血清稀釋的羊抗鼠二抗，室溫孵育1h后，PBST洗滌，DAB顯色，常規(guī)脫水、干燥、封片。

免疫組化評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：P-gp蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜，每張切片選取10個(gè)視野，放大400倍，計(jì)算腫瘤組織中P-gp表達(dá)陽性細(xì)胞的比率。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞的比例＜25%視為陰性，認(rèn)為非耐藥性；陽性細(xì)胞大于25%視為陽性，認(rèn)為耐藥性。

1．6 療效觀察 近期療效評(píng)定根據(jù)世界衛(wèi)生組織客觀療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定，分為完全緩解、部分緩解、無變化和進(jìn)展。有效率＝（完全緩解＋部分緩解）／總例數(shù)。遠(yuǎn)期療效采用1年、2年生存率進(jìn)行評(píng)定。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，累計(jì)生存率和累積復(fù)發(fā)率比較采用Kaplan-Meier和Log-Rank檢驗(yàn)，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 肝癌組織中MDR1mRNA表達(dá)水平 肝癌組患者腫瘤組織中平均MDR1mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖1）；以MDR1mRNA／正常水平＝2作為臨界值，肝癌組患者M(jìn)DR1mRNA／正常水平低于2的患者32例，MDR1mRNA／正常水平大于2的患者76例。

圖1 對(duì)照組和肝癌組患者肝組織中MDR1mRNA水平比較Fig．1 Comparison of MDR1mRNA level in control group and observation group

2．2 肝癌組織中MDR1編碼產(chǎn)物P-gp水平 肝癌組織中P-gp主要表達(dá)于肝癌細(xì)胞的細(xì)胞膜（圖2）。根據(jù)評(píng)定結(jié)果，35例患者為陰性，73例確定為P-gp表達(dá)陽性。在MDR1mRNA／正常水平大于2的患者中有3例P-gp水平表達(dá)較低，被診斷為陰性。

圖2 原發(fā)性肝癌患者肝組織中P-gp表達(dá)水平Fig．2 P-gp expression in patients with primary liver cancer（×400）

2．3 耐藥組和非耐藥組患者療效的比較 非耐藥組患者經(jīng)TACE后臨床有效率為74．28%，耐藥組的臨床緩解率為43．84%，非耐藥組患者臨床緩解率明顯高于耐藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，表1）。

表1 耐藥組和非耐藥組患者臨床緩解率的比較Tab．1 Comparison of clinical efficacy in non-resistance group and resistance group

2．4 耐藥組和非耐藥組患者生存率的比較 耐藥組患者中位生存時(shí)間為8．5個(gè)月，非耐藥組患者中位生存時(shí)間為11．7個(gè)月，非耐藥組患者中位生存時(shí)間明顯高于耐藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖3）。耐藥組患者1年、2年累積生存率為54．12%和27．40%，非耐藥組1、2年累積生存率為77．14%和42．86%。耐藥組患者1、2年累積生存率明顯低于非耐藥組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

3 討 論

TACE是治療無法手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌的常用方法，可減少患者的痛苦，延長患者生存時(shí)間［11-12］。但是，TACE治療原發(fā)性肝癌的長期效果不佳，主要原因是原發(fā)性肝癌存在明顯的MDR現(xiàn)象。MDR是指在腫瘤治療過程中，由一種抗腫瘤藥物引起，但同時(shí)又對(duì)其他多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象［13］。MDR現(xiàn)象廣泛存在于多種腫瘤中，成為目前臨床腫瘤治療的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

圖3 非耐藥組和耐藥組患者生存率的比較Fig．3 Comparison of survival rate in non-resistance group and resistance group

近年來，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，對(duì)腫瘤MDR機(jī)制的研究取得了顯著進(jìn)展。在腫瘤多種耐藥機(jī)制中，其中以膜糖蛋白介導(dǎo)的化療藥物的外泵機(jī)制較為深入，其中MDR1基因編碼產(chǎn)物P-gp在MDR中發(fā)揮著重要作用。MDR1基因是ATP結(jié)合家族成員之一，其編碼的P-gp是一個(gè)跨膜糖蛋白，有1 280個(gè)氨基酸組成，該蛋白有2個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)，通過與ATP結(jié)合將化療藥物泵出細(xì)胞，而發(fā)揮耐藥作用［14-16］。P-gp的表達(dá)與蒽環(huán)類化合物、長春堿類、紫杉醇類、鬼臼毒素類及放線菌素D的耐藥性密切相關(guān)［17］。

本研究檢測(cè)了原發(fā)性肝癌組織中MDR1基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示較正常肝組織明顯升高，約2／3的患者表達(dá)水平超過正常水平2倍，提示在肝癌組織中MDR1基因的轉(zhuǎn)錄處于激活狀態(tài)。這一結(jié)果與目前報(bào)道一致［18］。此外，實(shí)驗(yàn)通過免疫組化檢測(cè)，結(jié)果顯示MDR1mRNA表達(dá)水平較高的肝癌患者肝組織中的MDR1編碼產(chǎn)物P-gp表達(dá)水平明顯升高，蛋白水平與mRNA水平一致。值得注意的是3例MDR1 mRNA／正常水平大于2的肝癌患者，在免疫組化檢測(cè)中其編碼產(chǎn)物P-gp的水平低于25%，這3例患者的 MDR1mRNA／正常水平的比值分別為2．2、2．4和2．1，可能導(dǎo)致了在免疫組化檢測(cè)中出現(xiàn)上述結(jié)果，由于耐藥與P-gp蛋白水平有關(guān)，因此在本研究中將3例患者歸于非耐藥組。

本研究進(jìn)一步分析P-gp表達(dá)水平與原發(fā)性肝癌TACE療效的關(guān)系及臨床意義。結(jié)果顯示非耐藥患者臨床治療有效率明顯高于耐藥組患者，非耐藥組患者的臨床治療有效率較耐藥組患者高30．44%，說明原發(fā)性肝癌的腫瘤耐藥嚴(yán)重影響化療藥物的臨床治療效果。此外，TACE后非耐藥組患者1年、2年生存率明顯高于耐藥組患者，說明非耐藥組患者的TACE長期療效較好。

綜上所述，P-gp的高表達(dá)在部分原發(fā)性肝癌組織中表達(dá)異常，會(huì)直接影響TACE的短期和長期療效。因此，臨床化療前通過檢測(cè)患者肝癌組織中P-gp水平，對(duì)選擇化療并取得較好的抗腫瘤效果，有一定的臨床指導(dǎo)意義。

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