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改良人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離及鑒定*

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1849.012.html

崔麗麗， 余芳芳， 左麗**

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 優(yōu)化人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的分離及培養(yǎng)方法。方法： 在傳統(tǒng)HUVECs分離的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，通過Ⅰ型膠原酶消化分離HUVECs，利用倒置顯微鏡觀察其生長(zhǎng)狀況、免疫組織化學(xué)方法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所培養(yǎng)細(xì)胞的純度。結(jié)果： 改良實(shí)驗(yàn)步驟和精簡(jiǎn)操作后，HUVECs分離不受影響，分離的HUVECs在體外2～4 d可長(zhǎng)成單層，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈“鵝卵石”狀排列，Ⅷ因子免疫組化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞純度達(dá)99.37%。結(jié)論： 用膠原酶消化法分離HUVECs具有培養(yǎng)周期短，所獲得的HUVECs純度較高的優(yōu)點(diǎn)，有利于體外血管內(nèi)皮細(xì)胞模型的建立。

[關(guān)鍵詞]內(nèi)皮，血管; 臍靜脈； 免疫組織化學(xué)； 細(xì)胞培養(yǎng)； 細(xì)胞分離； 流式細(xì)胞術(shù)

血管是人體的重要器官，血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VECs)是覆蓋其內(nèi)膜表面的單層扁平或多角形的細(xì)胞。VECs既是感應(yīng)細(xì)胞又是效應(yīng)細(xì)胞，不僅能感知血液中的炎性信號(hào)、激素水平、切應(yīng)力及壓力等信息，而且能通過分泌多種血管活性物質(zhì)對(duì)這些信息作出反應(yīng)。血管內(nèi)皮細(xì)胞在生理止血、血管滲透及血管對(duì)于其他生理性和病理性刺激做出的反應(yīng)中起重要的作用[1-6]。血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)是體外研究大血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要手段。Jaffe等[7]首次從人臍靜脈中分離出內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)并在體外培養(yǎng)成功后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell， HUVECs) 作為體外研究 ECs 的模型受到研究者的關(guān)注。新生兒臍帶由于取材方便，來源充足，而成為體外內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的主要材料。本實(shí)驗(yàn)采用改良的膠原酶消化法分離培養(yǎng)HUVECs、免疫組化法對(duì)其進(jìn)行鑒定及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)純度，通過改良方法可大量獲得純度較高的血管內(nèi)皮細(xì)胞。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來源與采集

標(biāo)本均來自于正常足月娩出的新生兒臍帶。配制含0.49%葡萄糖的PBS緩沖液150 mL裝于已泡酸處理的250 mL玻璃瓶中，4 ℃保存待用。取臍帶時(shí)將臍帶無菌條件下浸入瓶中，運(yùn)輸時(shí)加冰袋保持低溫，取材后3 h內(nèi)完成對(duì)HUVECs處理。

1.1.2主要試劑與儀器

M199/EBSS培養(yǎng)液(Hyclone)、胎牛血清(Gibico 公司, 美國(guó))、Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國(guó))、Hanks液(corning公司，美國(guó))、0.25%胰蛋白酶(Hyclone)、 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加物(ECGS, Sciencell 公司, 美國(guó)) , 雙抗(Hyclone)、肝素納、明膠, 兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國(guó)) , FITC-抗人 CD31 抗體 (Abcam公司, 美國(guó)) 。倒置顯微鏡(NIKON 公司, 日本) , 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司, 中國(guó)) , 體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱 (Thermo，美國(guó)) , 離心機(jī)(Thermo，美國(guó)) , 流式細(xì)胞儀(Beckman公司, 美國(guó)) 。

1.2方法

1.2.1HUVECs分離、培養(yǎng)

取新生兒臍帶約20 cm，剔除血腫以及壞死出血部位，用7號(hào)輸液器針頭插入臍靜脈一端，止血鉗固定，用4 ℃預(yù)冷的PBS 100 mL沖洗臍靜脈完全去除紅細(xì)胞。夾閉臍帶另一端，注入37 ℃預(yù)溫處理(用Hanks液配制)的0.1%I型膠原酶10 mL于臍靜脈內(nèi)，用手輕揉按摩臍帶，使其分布均勻，消化充分，將裝有臍帶的無菌鋁盒放入5% CO2溫箱37 ℃孵育15 min。用50 mL無菌離心管收集臍靜脈內(nèi)的消化液， PBS反復(fù)沖洗臍靜脈，沖洗液也收集于50 mL無菌離心管中，800 r/min離心5 min，棄上清，沉淀即為HUVECs。往沉淀加入M199培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、50 mg/L ECGS、100 U/mL 青霉素、100 Ug/mL 鏈霉素及0.1 g/L肝素)，重懸細(xì)胞沉淀，接種于用明膠包被的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶明膠(提前1 d用明膠包被，用前用PBS緩沖液洗滌1～2次)，放入5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，24 h后全量換液，此后1～2 d換液1次，直至細(xì)胞80%～90%融合。

1.2.2HUVECs傳代培養(yǎng)

原代內(nèi)皮細(xì)胞融合至80%～90%后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2～3次，加入0.25%胰蛋白酶1 mL 37 ℃消化5 min，鏡下觀察細(xì)胞皺縮變圓，彼此分離或大片狀分離時(shí)加入3～4倍胰酶體積的M199培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)終止消化，重懸細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3HUVECs的鑒定方法

1.2.3.1HUVECs形態(tài)鑒定用倒置顯微鏡每天鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.3.2Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測(cè)將HUVECs懸液接入96孔板，100 μL/孔(105個(gè)/孔)，細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，采用免疫組織化學(xué)法鑒定Ⅷ因子相關(guān)抗原，一抗為兔抗人內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體(稀釋比例為1∶50)，陰性對(duì)照為BHK細(xì)胞，空白對(duì)照用PBS。

1.2.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)取2瓶基本長(zhǎng)滿的HUVECs，用0.25%胰蛋白酶消化，離心棄上清。加入10%胎牛血清重懸細(xì)胞，室溫或4 ℃孵育15 min，用PBS洗滌1次，離心后用1 200 μL PBS將細(xì)胞重懸，均分為3份。1份加入5 μL FITC標(biāo)記抗CD31抗體作為檢測(cè)組；1份作為陰性，不加任何抗體；1份作為同型對(duì)照，加入5 μL相關(guān)同型抗體(eBioscience,鼠 IgG1，κ，F(xiàn)ITC)。3份樣品均4 ℃孵育30 min， PBS洗滌2次，重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)CD31表達(dá)。

2結(jié)果

2.1HUVECs形態(tài)

接種分離原代HUVECs 4 h 后，細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng), 1～2 d后融合成片, 即原代培養(yǎng)的周期為2～3 d。 第1天見細(xì)胞呈梭形，成團(tuán)貼壁,逐漸向外擴(kuò)散生長(zhǎng),呈單層, 胞核呈圓形或橢圓形,呈“鵝卵石”狀排列(圖1)。

2.2Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測(cè)

免疫組織化學(xué)染色示，細(xì)胞呈圓形、梭形或多邊形, 胞漿內(nèi)含有棕黃色顆粒，此為Ⅷ因子陽(yáng)性特征，證實(shí)為內(nèi)皮細(xì)胞(圖2)。

原代培養(yǎng)24 h 　　　　　　　　　　　　　　　　　原代培養(yǎng)第2天圖1　原代HUVECs培養(yǎng)(100×)Fig.1　Primary culture of HUVECs

Ⅷ因子陽(yáng)性(HUVEC)　　　　　　　　　　　　　　　陰性對(duì)照 (BHK)圖2　免疫組化鑒定HUVECs(100×)Fig.2　Identification of HUVECs with immunohistochemisty

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 血管內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)于CD31是另一特征性表現(xiàn)。目前，國(guó)內(nèi)外普遍采用CD31作為指示血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞的指標(biāo)。流式細(xì)胞結(jié)果顯示，HUVECs表面高表達(dá)CD31分子，紅色為同型對(duì)照，綠色為檢測(cè)的樣本,99.37%的細(xì)胞表面抗原CD31表達(dá)陽(yáng)性，表明所分離培養(yǎng)的HUVECs純度高達(dá)99.37%(圖3)。

圖3　HUVECs表面CD31表達(dá)Fig.3　Expression of CD31 on the surface of HUVECs

3討論

1973年 Jaffe等[7]首次報(bào)道了內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法,隨后大批學(xué)者對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法進(jìn)行了一系列的改進(jìn)和創(chuàng)新[8-9]。但由于影響內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的因素較多，原代HUVECs的獲得率較低，且傳代次數(shù)有限。本研究通過總結(jié)前人的方法，改進(jìn)了HUVECs提取方法，獲得了較高純度的原代HUVECs，要點(diǎn)如下：(1)臍帶采用含葡萄糖的PBS緩沖液保存在 4 ℃進(jìn)行運(yùn)輸，取材后3 h內(nèi)完成對(duì)HUVECs處理，保護(hù)了臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的活性，提高了臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的獲得率；(2)采用Ⅰ型膠原酶進(jìn)行消化，膠原酶較溫和，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷較少，可獲得數(shù)量較多的內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)HUVECs貼壁生長(zhǎng)無太大的影響，克服了傳統(tǒng)方法采用胰蛋白酶消化對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞的損傷較大的缺點(diǎn)；(3)采用含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液，并加入ECGS及肝素，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，增殖及貼壁[10-11]，使內(nèi)皮細(xì)胞在1～2 d有90%融合長(zhǎng)成單層細(xì)胞；(4)細(xì)胞傳代用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化5 min，立即加入胰蛋白酶體積3～4倍10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液終止消化，減少了細(xì)胞的損傷；(5)用明膠包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的貼壁性；(6)本研究在傳代過程中發(fā)現(xiàn)原代HUVECs傳至第5代后形態(tài)有所改變，貼壁性較差的現(xiàn)象，采用細(xì)胞傳代至第5代時(shí)進(jìn)行研究，即可保持細(xì)胞的活性，還可保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。

本研究獲得的原代HUVECs，鏡下細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，以“鵝卵石”狀排列，免疫組織化學(xué)染色示細(xì)胞呈圓形、梭形或多邊形, 胞漿內(nèi)含有棕黃色顆粒，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD31表達(dá)陽(yáng)性高達(dá)99.37%，成功分離并獲得大量純度較高的HUVECs。為HUVECs模型模型的建立提供更加簡(jiǎn)便宜、快速的方法。

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(2014-09-08收稿，2014-10-15修回)

Improved Isolation and Identification of Primary Vascular

Endothelial Cells from Human Umbilical Veins

CUI Lili, YU Fangfang, ZUO Li

(TeachingDivisionofImmunology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To optimize the isolation and nurturing method of the human umbilical vein endothelial cell (HUVECs), to conclude identification methods of HUVEC. Method: Improving the traditional isolation of HUVECs, isolating HUVECs by type I collagenase. Then the growth of cells was observed under an inverted microscope, the cultured cells were identified by immunocytochemistry, and the purity of cells was identified by flow cytometry. Result: Improved experimental procedures and simplified the operation, the isolation of HUVECs was not affected, the primary HUVECs began to grow into a single layer about 2～4 days in vitro, arrayed like "cobblestone"shape under the inverted microscope.Ⅷ factor in the HUVECs showed positive reaction by immunocytochemistry, the purity was 99.37% by flow cytometry. Conclusions: Collagenase procedure is convenient and high purified HUVECs can be acquired. It can successfully establish the model for endothelial cells.

[Key words]endothelium, vascular; umbilical veins; immunocytochemistry; cell culture; cell separation;flow cytometry

[中圖分類號(hào)]R329.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2015)01-0020-04

通信作者**E-mail:zuoligymc@163.com網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-01-13

[基金項(xiàng)目]*國(guó)家自然科學(xué)基金 (31260224)