馬永達，王旭輝，陳 強

1.第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所麻醉科，重慶 400042;2.第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所神經(jīng)外科，重慶 400042

交通事故傷所造成的創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)已經(jīng)成為青年人致殘和死亡的主要原因。腦損傷的預防和傷后救治成為一個亟待解決的問題。TBI的病理機制是一個復雜的、多重因素相互重疊、共同作用的過程。膜通透性增加、自由基損傷、興奮性氨基酸中毒、缺血及再灌注損傷等都參與其中，而神經(jīng)元胞內鈣超載是上述所有致傷因素的共同通路。因此，研究創(chuàng)傷后神經(jīng)元胞內鈣代謝的變化規(guī)律，對于保護神經(jīng)元功能、改善TBI的救治效果具有重要意義。筆者對糖皮質激素(glucocorticoid，GC)調節(jié)創(chuàng)傷后神經(jīng)元胞膜鈣泵的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 GC在TBI后腦保護中運用

GC由于其強大的抗炎、抗氧化、穩(wěn)定生物膜等作用，一直被用于治療TBI［1］，但其作用機制沒有闡明。研究發(fā)現(xiàn)，GC可以通過不同的作用方式對神經(jīng)元起到保護作用，如GC可以直接激活生長因子受體，并引發(fā)相關效應，起到神經(jīng)保護作用［2-3］;促進神經(jīng)保護性物質，如精氨酸和還原型谷胱甘肽的合成［4］;上調 Bcl-2、Bcl-x等保護性因子，增強神經(jīng)元對抗神經(jīng)毒素的能力［5］;抗炎、抗氧化;激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路(3-Akt-kinase通路)等機制，避免TBI后神經(jīng)元的死亡，從而對神經(jīng)元起到保護作用［6］。另外，GC調節(jié)神經(jīng)元胞內鈣代謝水平狀況，是發(fā)揮保護作用的重要途徑之一。因此，GC對生物體作用是廣泛而復雜的，只有在更加詳細地了解其錯綜復雜機制的基礎上，才能在不同疾病的不同階段正確使用，從而最大程度發(fā)揮其保護作用。

2 胞內鈣超載是TBI后神經(jīng)元發(fā)生損傷和凋亡的共同通路

細胞內的鈣超載和平衡失調是TBI后短期內神經(jīng)元壞死和凋亡的重要原因［2］，并可能與TBI后長期神經(jīng)功能障礙(如突觸可塑性和學習、記憶［7］)和對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病易感性增加有關［8］。既往研究曾從控制鈣內流系統(tǒng)(主要為各種鈣通道)入手改善TBI后神經(jīng)元內鈣離子失衡。研究顯示，L型鈣通道阻滯藥可以在損傷后保護神經(jīng)元，并且臨床研究顯示可以減少不良預后［1］。證明阻滯細胞鈣離子的大量內流，是減少神經(jīng)元鈣超載，保護神經(jīng)元免于死亡的途徑之一。已有研究表明，鈣清除系統(tǒng)(包括細胞膜鈣泵、膜鈉鈣交換體、內質網(wǎng)鈣泵和線粒體鈣轉運體)在細胞的損傷乃至死亡過程中同樣占有重要地位，是細胞損傷及凋亡的共同通路之一［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，在細胞凋亡的過程中，細胞膜上重要的鈣清除分子—細胞膜鈣泵(plasma membrane Ca2+ATPase，PMCA)作為capase-3的底物被裂解［10］;興奮性氨基酸中毒的損傷過程中，胞膜鈣泵和胞膜的鈉-鈣交換體(Na-Ca exchange，NCX)可被某些蛋白酶分解，從而進一步削弱細胞維持胞漿鈣離子平衡的能力，形成鈣超載，最終導致細胞凋亡;而阻斷PMCA和NCX的裂解則可以減少興奮性毒素所導致的凋亡［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，某些神經(jīng)保護因子可以通過調整PMCA的活性，實現(xiàn)其神經(jīng)元保護作用［6，12］，表明神經(jīng)元損傷后，鈣清除系統(tǒng)的正常運轉也是防止細胞內鈣超載，進而防止細胞死亡的重要因素。因此，降低 TBI后神經(jīng)元胞內鈣超載是保護神經(jīng)元的重要措施之一。

3 GC調節(jié)TBI后神經(jīng)元胞內鈣超載的途徑

Chen等［13］研究證實，GC可以降低創(chuàng)傷后神經(jīng)元胞內鈣超載的水平，這是GC發(fā)揮保護作用的重要途徑之一。研究提示，阻斷創(chuàng)傷后神經(jīng)元鈣超載這一共同通路，有可能改善創(chuàng)傷性神經(jīng)元損傷的保護作用。

通常參與神經(jīng)元胞內鈣代謝的途徑有PMCA、NCX、內質網(wǎng)鈣泵(sarcoplasnic reticulum Ca2+ATPase，SERCA)和線粒體鈣轉運體。有研究提示，GC可以調節(jié)創(chuàng)傷后神經(jīng)元細胞內的鈣超載，主要表現(xiàn)為GC可以抑制某些神經(jīng)遞質引發(fā)的鈣內流，還可以激活內質網(wǎng)鈣泵［14］，防止胞質內鈣離子過度升高;而在調節(jié)創(chuàng)傷后神經(jīng)元胞內鈣代謝時，GC是否具有主動將胞內超載的鈣離子轉運至胞外的能力，避免創(chuàng)傷后神經(jīng)元胞內鈣超載，進而防止神經(jīng)元細胞凋亡或死亡，達到保護神經(jīng)系統(tǒng)功能的作用，但其相關報道較少，因此有必要對其進行深入的研究。

4 GC在介導PMCA減輕神經(jīng)元胞內鈣超載中的作用

為了探討GC通過介導PMCA對神經(jīng)元胞質內鈣瞬變的影響，Chen等［13］在前期分別用1×10-6、1×10-9mol/L的地塞米松(DEX)作用于神經(jīng)元。為了最大限度地減少細胞外鈣離子對觀察結果的影響，Chen等［13］設計了細胞外無鈣的觀察條件。研究發(fā)現(xiàn)，1×10-6mol/L DEX能夠激活PMCA，導致細胞內鈣離子濃度迅速下降，而1×10-9mol/L的DEX沒有這種生物效應;使用KB-R7943和毒胡蘿卜素(thapsigargin)阻滯NCX和SERCA不能影響這種效應，但是用pH值8.8的細胞外液阻斷PMCA后，則完全阻滯了DEX所導致的鈣下降現(xiàn)象。提示GC導致細胞內鈣離子濃度迅速下降的原因在于激活PMCA，而與NCX和SERCA的活性變化沒有明顯關系［13］。研究結果提示，神經(jīng)元受到創(chuàng)傷后，胞內發(fā)生鈣超載的關鍵因素之一可能在于PMCA的異常。

5 GC介導PMCA調節(jié)TBI后胞內鈣超載機制分析

通常認為GC可以自由通過細胞膜，然后與胞質內受體及相關蛋白結合形成配體-受體復合體，再轉入細胞核內與DNA某些元件結合進而調控轉錄過程，一般認為這個過程至少需要15 min。雖然近幾年研究發(fā)現(xiàn)，在某些細胞內這兩個過程進行是比較迅速的，但即便如此，基因組機制發(fā)生作用的時間也通常＞5 min;而GC所介導的細胞內鈣離子變化是極為迅速的，認為這就是GC介導神經(jīng)元胞內鈣離子調節(jié)的非基因組機制［15］。非基因組機制認為，GC可以與膜相關受體結合，通過激活相應的細胞內信號通路迅速產生效應［4］。非基因組過程具有一些不同于基因組機制的特點，如不能被轉錄和翻譯的抑制劑所阻滯，經(jīng)過修飾而不能穿透細胞的GC仍能夠引發(fā)相應的效應［16］。在尚未發(fā)現(xiàn)GC膜受體的情況下，這些特性也成為證明非基因組機制的常用方法。

GC介導的PMCA對神經(jīng)元胞質內鈣瞬變的調控迅速，作用時間短于傳統(tǒng)的基因組機制，其作用機制可能在于非基因組調控機制。由GC介導的PMCA對神經(jīng)元胞質內鈣瞬變的調控機制研究，其相關文獻報道較少，有待進一步研究。

關于TBI的體外模型，近年來由于可變形培養(yǎng)皿的使用，取得了許多進展。通過改變培養(yǎng)皿的底面積，模擬TBI狀態(tài)下神經(jīng)元的牽張損傷。并可通過計算機控制牽張的速度、幅度等參數(shù)，從而獲得更為穩(wěn)定的TBI體外模型。本研究的另一個關鍵是PMCA活性的測定。一般使用兩種方法:(1)一種是提取然后檢測 PMCA活性，這包括兩種措施:①一種是從細胞勻漿中提取膜結構，聯(lián)合使用多種三磷酸腺苷酶(ATP酶)抑制劑，抑制除PMCA之外所有ATP酶的活性，就可以單獨測定PMCA分解底物的能力，從而鑒定其活性［17］;②另一種是從勻漿中通過親和色譜的方法提出泵蛋白，直接檢測其活性［18-19］;(2)另一種檢測PMCA活性的方法是通過觀察其清除胞質內鈣的能力，間接確定其活性。既往研究多是通過激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測細胞內鈣熒光變化，聯(lián)合膜片鉗控制細胞內鈣升高的幅度，并抑制除PMCA之外所有的鈣清除分子，創(chuàng)造一個完全由PMCA介導的鈣清除過程，并以此為平臺，測定各種因素對于PMCA活性的影響。這種方法的缺點是可同時觀測的細胞只能為一個，樣本量受到限制;而且，所需設備昂貴，不易獲得。Chen等［13］曾將神經(jīng)元置于無鈣的緩沖液中一段時間，然后加入含鈣緩沖液，能夠迅速促使鈣離子內流，從而使神經(jīng)元內鈣離子升高，并以此作為平臺進行研究。

6 結語

GC對TBI后神經(jīng)元具有保護作用，其作用機制是多方面的，這不僅表現(xiàn)在GC具有強大的抗炎、抗氧化、穩(wěn)定細胞膜上，還可以通過調節(jié)神經(jīng)元胞內鈣代謝水平的變化，從而防止TBI后神經(jīng)元發(fā)生胞內鈣超載，進而達到防止神經(jīng)元凋亡或壞死的作用。既往的研究主要集中于創(chuàng)傷后神經(jīng)元的鈣清除系統(tǒng)的異常，包括PMCA、NCX、SERCA和線粒體鈣轉運體的功能異常;最近則發(fā)現(xiàn)，應激水平的GC不僅具有主動調節(jié)PMCA從而調節(jié)胞內鈣代謝，同時還具有調節(jié)TBI后神經(jīng)元胞內鈣超載的能力，這一系列的發(fā)現(xiàn)有助于進一步闡明GC對TBI后神經(jīng)元保護機制，也為 TBI后合理使用GC提供理論支持。

［1］Maas AI，Stocchetti N，Bullock R.Moderate and severe traumatic brain injury in adults［J］.Lancet Neurol，2008，7(8):728-741.

［2］Agrawal A，Cincu R，Timothy J.Corticosteroids and head injury［J］.Clin Neurol Neurosurg，2008，110(4):421-422.

［3］Jeanneteau F，Garabedian MJ，Chao MV.Activation of Trk neurotrophin receptors by glucocorticoids provides a neuroprotective effect［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(12):4862-4867.

［4］Malcher-Lopes R，F(xiàn)ranco A，Tasker JG.Glucocorticoids shift arachidonic acid metabolism toward endocannabinoid synthesis:a non-genomic anti-inflammatory switch［J］.Eur J Pharmacol，2008，583(2-3):322-339.

［5］Harms C，Albrecht K，Harms U，et al.Phosphatidylinositol 3-Aktkinase-dependent phosphorylation of p21(Waf1/Cip1)as a novel mechanism of neuroprotection by glucocorticoids［J］.J Neurosci，2007，27(17):4562-4571.

［6］Maas AI，Menon DK，Lingsma HF，et al.Reorientation of clinical research in traumatic brain injury:Report of an internation workshop on comparative effectiveness research［J］.J Neurotrauma，2012，29(1):32-46.

［7］Deshpande LS，Sun DA，Sombati S，et al.Alterations in neuronal calcium levels are associated with cognitive deficits after traumatic brain injury［J］.Neurosci Lett，2008，441(1):115-119.

［8］Sun DA，Deshpande LS，Sombati S，et al.Traumatic brain injury causes a long-lasting calcium(Ca2+)-plateau of elevated intracellular Ca levels and altered Ca2+homeostatic mechanisms in hippocampal neurons surviving brain injury［J］.Eur J Neurosci，2008，27(7):1659-1672.

［9］Knot HJ，Laher I，Sobie EA，et al.Twenty years of calcium imaging:cell physiology to dye for［J］.Mol Interv，2005，5(2):112-127.

［10］Padányi R，Xiong Y，Antalffy G，et al.Apical scaffolding protein NHERF2 modulates the localization of alternatively spliced plasma membrane Ca2+pump 2B variants in polarized epithelial cells［J］.J Biol Chem，2010，285(41):31704-31712.

［11］Araujo IM，Carreira BP，Pereira T，et al.Changes in calcium dynamics following the reversal of the sodium-calcium exchanger have a key role in AMPA receptor-mediamed neurodegeneration via calpain activation in hippocampal neurons［J］.Cell Death Differ，2007，14(9):1635-1646.

［12］Roome CJ，Empson RM.The contribution of the sodium-calcium exchanger(NCX)and plasma membrane Ca(2+)ATPase(PMCA)to cerebellar synapse function［J］.Adv Exp Med Biol，2013，961:251-263.

［13］Chen S，Wang XH，Zhang XZ，et al.High-dose glucocorticoids induce decreases calcium in hypothalamus neurons via plasma membrane Ca2+pumps［J］.Neuroreport，2011，22(13):660-663.

［14］Xiao L，F(xiàn)eng C，Chen Y.Glucocorticoid rapidly enhances NMDA-evoked neurotoxicity by attenuating the NR2A-containing NMDA receptor-mediated ERK1/2 activation［J］.Mol Endocrinol，2010，24(3):497-510.

［15］Ju H，Wang X，Liu Z，et al.Identification and tissue distribution of a novel rat glucocorticoid receptor splice variant［J］.Acta Biochim Pol，2009，56(1):109-113.

［16］Haller J，Mikics E，Makara GB.The effects of non-genomic glucocorticoid mechanisms on bodily functions and the central neural system.A critical evaluation of findings［J］.Front Neuroendocrinol，2008，29(2):273-291.

［17］Oz OK，Hajibeigi A，Howard K，et al.Aromatase deficiency causes altered expression of molecules critical for calcium reabsorption in the kidneys of female mice［J］.J Bone Miner Res，2007，22(12):1893-1902.

［18］Yu YG，Tang FG，Pan J，et al.Effects of phenylalanine and its metabolites on cytoplasmic free calcium in cortical neurons［J］.Neurochem Res，2007，32(8):1292-1301.

［19］Fernandes D，Zaidi A，Bean J，et al.RNA-induced silencing of the plasma membrane Ca2+-ATPase 2 in neuronal cells:effects on Ca2+homeostasis and cell viability［J］.J Neurochem，2007，102(2):454-465.