劉憲民,杜明昌,柳 椰,鄔 波,劉松波,王 琪,項(xiàng)良碧
1.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院骨科全軍重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷救治中心,遼寧沈陽(yáng)110016;2.沈陽(yáng)市骨科醫(yī)院,遼寧沈陽(yáng) 110044
骨性關(guān)節(jié)炎是累及關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨及滑膜等組織結(jié)構(gòu)的慢性疾病,是生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)及酶的反饋?zhàn)饔玫葟?fù)雜的多種機(jī)制相互作用的結(jié)果。軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞在骨性關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程中,代謝平衡被打亂,代謝產(chǎn)物相互影響,具有能夠促進(jìn)軟骨降解、促進(jìn)滑膜炎癥或促進(jìn)軟骨合成等多種作用。炎癥因子水平一定程度上反映了骨性關(guān)節(jié)炎的病理變化。本研究通過(guò)建立膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損、軟骨下骨外露動(dòng)物模型,應(yīng)用自體脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)移植修復(fù)軟骨缺損,觀察ADSCs移植后不同時(shí)間點(diǎn)軟骨缺損修復(fù)與關(guān)節(jié)滑液中反應(yīng)骨、軟骨代謝的相關(guān)炎性細(xì)胞因子,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleakin-1β,IL-1β)和基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)水平的變化[1-3],以評(píng)估 ADSCs移植對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)作用。
1.1 材料和儀器 低糖-培養(yǎng)基LG-DMEM(英杰生命科技有限公司);胎牛血清(FBS,GE Healthcare公司);L-谷氨酰胺(廣州賽業(yè)生物科技有限公司);青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶(廣州賽業(yè)生物科技有限公司);Ⅰ型膠原海綿(無(wú)錫貝迪生物有限公司);Ⅰ型膠原酶(美國(guó) Sigma公司)。IL-1β、TNF-α、MMP-13用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)。
1.2 實(shí)驗(yàn)分組及豬原代ADSCs的獲取 選用6個(gè)月齡的巴馬小型豬12只,體質(zhì)量20~25 kg,雌雄不限(由黑龍江省雙鴨山市科技小型豬養(yǎng)殖場(chǎng)提供)。采用自體左、右后肢對(duì)照,造模后分別采用自體ADSCs移植治療(A組)及微骨折治療(B組)。全麻后氣管插管輔助通氣(沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心),取仰臥位,剃毛、消毒、鋪無(wú)菌單,采用真空負(fù)壓吸脂法吸取皮下脂肪約50 g。采用密度梯度離心法分離ADSCs,加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液10 ml(含LG-DMEM,10%FBS,L-谷氨酰胺 300 μg/ml,抗壞血酸 50 μg/ml,青霉素、鏈霉素各 100 U/ml),制成單細(xì)胞懸液,采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)獲取細(xì)胞的數(shù)量(獲取的細(xì)胞用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn))。
1.3 細(xì)胞支架的制備 (1)用無(wú)菌剪刀將Ⅰ型膠原海綿剪成7 mm×7 mm×3 mm大小的方塊,分別放入24孔板中,備用;(2)向軟骨分化誘導(dǎo)因子的溶液制備:以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGF-β2)及胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)為軟骨分化誘導(dǎo)因子,利用兩種因子的水溶性,配制濃度為20 ng/ml TGF-β2和400 ng/ml IGF-1的溶液;(3)將誘導(dǎo)液加入24孔板中,其中每孔加入誘導(dǎo)液1 ml,利用膠原海綿的吸水性,使膠原海綿支架與誘導(dǎo)液充分接觸均勻?;旌?0 min后,將24孔板放入-80℃冰箱進(jìn)行預(yù)凍8 h。最后將24孔板放入LGJ-冷凍干燥機(jī)。凍干后按照不同濃度將Ⅰ型膠原海綿和誘導(dǎo)因子復(fù)合支架密封包裝,進(jìn)行60Co照射后備用。
1.4 ADSCs支架復(fù)合體細(xì)胞的體外復(fù)合 取12孔培養(yǎng)板,取6孔,放入支架材料。將Ⅰ期獲取的細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個(gè)/ml。滴加在海綿支架上,放入培養(yǎng)箱孵育2 h。
1.5 豬關(guān)節(jié)軟骨缺損的制備及修復(fù) 全麻狀態(tài)下,仰臥,取膝關(guān)節(jié)正中切口,由髕骨內(nèi)側(cè)進(jìn)入關(guān)節(jié)腔,顯露關(guān)節(jié)軟骨,分別在內(nèi)、外髁用7 mm扁鑿制備邊長(zhǎng)為7 mm的正方形軟骨全層缺損,涉及軟骨下骨。將支架細(xì)胞復(fù)合物放入軟骨缺損部位。每組各3例,以吸收線縫合固定,分層關(guān)閉關(guān)節(jié)腔。術(shù)后不固定患肢,動(dòng)物圈中自由活動(dòng),術(shù)后3 d給予肌注青霉素240 萬(wàn) U,肌注2次/d[4-5]。
1.6 術(shù)后取材與檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于術(shù)后2、4個(gè)月取材,大體觀察軟骨缺損區(qū)修復(fù)的形態(tài),與正常組織界面等情況。收集關(guān)節(jié)內(nèi)滑液約0.3~0.5 ml,標(biāo)本送檢后,立即 4℃,14 000 r/min,離心20 min,留取上清液待測(cè)。ELISA檢測(cè) IL-1β、TNF-α、MMP-13 的表達(dá)。
2.1 軟骨缺損修復(fù)的大體觀察 術(shù)后2個(gè)月觀察:A組:關(guān)節(jié)面平整,白色膜狀物覆蓋缺損部位。缺損區(qū)由損傷邊緣開(kāi)始出現(xiàn)新生軟骨組織,色澤與周?chē)浌墙M織相近,質(zhì)實(shí)、有一定的彈性。B組:缺損部位明顯凹陷,邊緣有類(lèi)軟骨樣組織出現(xiàn),整個(gè)缺損部位,顏色深紅,與周?chē)浌墙M織區(qū)別明顯。見(jiàn)圖1。
術(shù)后4個(gè)月觀察:A組:肉眼觀察缺損處關(guān)節(jié)面平整,可見(jiàn)模糊邊界。缺損區(qū)覆蓋新生軟骨組織,色澤與周?chē)浌墙M織相近,質(zhì)實(shí)、有一定的彈性。B組:肉眼觀察缺損處修復(fù)組織表面不整,呈不規(guī)則凹陷。缺損邊緣修復(fù)為類(lèi)軟骨組織,由邊緣向缺損中心逐步凹陷,缺損邊緣與周?chē)M織邊界仔細(xì)辨認(rèn)可區(qū)分,修復(fù)組織顏色由邊緣向中心逐漸變深。見(jiàn)圖2。
圖1 術(shù)后2個(gè)月軟骨缺損修復(fù)大體觀察
圖2 術(shù)后4個(gè)月軟骨缺損修復(fù)大體觀察
2.2 關(guān)節(jié)滑液中炎癥因子的變化 兩組關(guān)節(jié)滑液術(shù)后炎癥因子變化見(jiàn)表1。
表1 兩組術(shù)后炎癥因子變化(±s)
表1 兩組術(shù)后炎癥因子變化(±s)
注:A、B 組術(shù)后2、4 個(gè)月的 IL-1β、TNF-α、MMP-13 表達(dá)水平比較,P <0.05;A、B 組自身前后 IL-1β、TNF-α、MMP-13 表達(dá)水平比較,P <0.05。
組別 術(shù)后時(shí)間TNF-α(pg/ml)(月) n IL-1β(pg/ml)MMP-13(ng/ml)個(gè)月A 組 2 6 80.46 ±8.92 47.38 ±10.54 69.18 ±9.24 30.55 ±2個(gè)月 4個(gè)月2個(gè)月 4個(gè)月2個(gè)月 4 11.18 120.74 ±15.92 73.16 ±16.25 B 組 4 6 109.58 ±9.37 92.35 ±11.29 93.82 ±12.56 78.74 ±10.28 189.24 ±17.63 140.38 ±14.82
目前研究認(rèn)為,骨性關(guān)節(jié)炎病因?qū)W主要有3個(gè)方面:一是關(guān)節(jié)軟骨破壞后軟骨細(xì)胞之間的代謝平衡喪失,二是炎性的滑膜組織釋放炎癥介質(zhì),三是軟骨下骨骨細(xì)胞代謝平衡喪失。正常情況下,軟骨、軟骨下骨通過(guò)對(duì)合成代謝與分解代謝進(jìn)行調(diào)節(jié),維持細(xì)胞外基質(zhì)的平衡。一旦退變或外傷等因素導(dǎo)致了軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞代謝異常,則會(huì)引起滑膜的代謝異常。炎性因子的出現(xiàn)會(huì)進(jìn)一步引起軟骨的代謝,分解代謝的強(qiáng)度逐漸超過(guò)合成代謝,造成軟骨基質(zhì)的丟失,最初造成軟骨的粗糙不平以及細(xì)小的裂隙,最終致軟骨下骨顯露[6]。
研究表明,多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子參與了骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的過(guò)程,如轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、胰島素樣因子(insulin-like growth factor,IGF)、胰島素樣因子結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor binding protein,IGFBP)、IL-1家族、TNF、成纖維生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,F(xiàn)GF)、黏附分子及整合素、基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)、組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrixmetallopreinase,TIMP)以及低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,HIF)。炎癥介質(zhì)大部分均為炎性的滑膜組織分泌,其中IL-l的浸潤(rùn)能夠增強(qiáng)關(guān)節(jié)軟骨MMP族中MMP-3、MMP-13的表達(dá),促進(jìn)軟骨基質(zhì)的降解,刺激軟骨細(xì)胞和滑膜產(chǎn)生NO,抑制軟骨細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡[7],加速軟骨細(xì)胞的退變,從而加劇退行性骨關(guān)節(jié)病,引起臨床上的一系列癥狀。TNF-α是由激活的巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞產(chǎn)生,有抑制成骨細(xì)胞和刺激破骨細(xì)胞的作用,是人體內(nèi)作用最廣泛的致炎因子之一。TNF-α一方面可激活MMPs導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解,另一方面,還可作為炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因子,擴(kuò)大并加重炎癥反應(yīng),導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨生存環(huán)境的改變,軟骨無(wú)法獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)而導(dǎo)致退變[8]。
從治療上講,由于軟骨的自身能力有限,一般認(rèn)為直徑超過(guò)4 mm的軟骨缺損不能自行修復(fù)。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展,多種治療手段已運(yùn)用于關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù),如關(guān)節(jié)內(nèi)清理和灌洗術(shù)、關(guān)節(jié)刨削成形術(shù)、軟骨下骨鉆孔術(shù)、微骨折、截骨術(shù)等傳統(tǒng)治療方法,但因修復(fù)組織以纖維軟骨為主,缺少正常透明軟骨的力學(xué)性能及耐用性,不可避免地會(huì)出現(xiàn)退行性變。所以,軟骨缺損修復(fù)的目標(biāo)是透明軟骨修復(fù),與周?chē)M織的高度整合,提供長(zhǎng)期關(guān)節(jié)表面光整以及一致的機(jī)械負(fù)載性能。近年來(lái),組織工程的迅速發(fā)展,特別是種子細(xì)胞體外培養(yǎng)的成熟,可降解生物材料的應(yīng)用,細(xì)胞生長(zhǎng)因子的發(fā)現(xiàn),為骨軟骨的修復(fù)提供了一個(gè)合乎生物學(xué)原則的思路[9-10]。
本研究利用ADSCs為種子細(xì)胞,復(fù)合在可緩釋誘導(dǎo)因子Ⅰ型膠原海綿支架上,移植修復(fù)軟骨缺損。通過(guò)大體觀察可發(fā)現(xiàn),術(shù)后2個(gè)月ADSCs移植修復(fù)組(A組)已經(jīng)有類(lèi)軟骨組織形成,術(shù)后4個(gè)月的軟骨缺損部位完全修復(fù),并形成透明軟骨組織。而且通過(guò)檢測(cè)關(guān)節(jié)滑液中炎性因子水平的變化,發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞移植修復(fù)組(A組)術(shù)后2、4個(gè)月后關(guān)節(jié)滑液中的 IL-1β、TNF-α、MMP-13表達(dá)水平均低于微骨折治療組(B組),且術(shù)后4個(gè)月的表達(dá)水平低于術(shù)后2個(gè)月的表達(dá)水平。根據(jù)這一結(jié)果,可以推斷應(yīng)用自體ADSCs移植修復(fù)軟骨缺損,不但可以從結(jié)構(gòu)上重建軟骨組織,而且可以改善滑膜、軟骨、軟骨下骨等組織的異常代謝,從而減輕軟骨缺損導(dǎo)致的不適癥狀。
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