魏　煒,張英新,張曉敏,蔣成君,周一峰

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,杭州 310023;2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,

杭州 310023;3.杭州普施康生物科技有限公司,杭州 310021)

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浙江科技學(xué)院學(xué)報(bào),第27卷第1期,2015年2月

Journal of Zhejiang University of Science and Technology

Vol.27 No.1, Feb. 2015

紫杉烷類PEG-PDLLA納米粒的制備及其體外評(píng)價(jià)

魏煒1,2,張英新3,張曉敏3,蔣成君1,2,周一峰1,2

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,杭州 310023;2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,

杭州 310023;3.杭州普施康生物科技有限公司,杭州 310021)

摘要:采用乳化-溶劑蒸發(fā)法制備紫杉烷類PEG-PDLLA納米粒,馬爾文激光粒度儀測(cè)其粒徑及Zeta電位;HPLC法測(cè)定納米粒包封率和載藥量;研究載藥納米粒在PBS中的釋放動(dòng)力學(xué);初步評(píng)價(jià)載藥納米粒在MGC803、HeLa細(xì)胞中的攝取及細(xì)胞毒性。結(jié)果表明,通過包載形成的納米粒的粒徑為(13±1)nm,分布較集中。載體與藥物的質(zhì)量比在20∶1時(shí),紫杉醇的均一性最好,卡巴他賽的包封率最高,達(dá)到88.77%。載藥納米粒具有較好的緩釋作用,MGC803、HeLa細(xì)胞的存活率降低,與臨床用注射劑效果相近。紫杉烷類PEG-PDLLA納米粒的性質(zhì)、釋放、細(xì)胞抑瘤率都較好,可為開發(fā)紫杉烷類新型靜脈注射制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞:紫杉烷類;PEG-PDLLA;納米粒;體外評(píng)價(jià);細(xì)胞毒性

紫杉烷類藥物主要包括紫杉醇(PTX)、多烯紫杉醇(DTX)、卡巴他賽(CBT),是目前臨床上最有效的抗腫瘤藥物之一。臨床研究已經(jīng)證實(shí)了PTX在治療多種實(shí)體腫瘤,包括乳腺癌、晚期卵巢癌、肺癌、腦部和頸部腫瘤及急性白血病等方面,都有顯著的作用。DTX的作用機(jī)制與紫杉醇相似,但抗腫瘤活性更好,對(duì)乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等癌癥具有明顯的治療效果[1-2]。CBT是為DTX耐藥的轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抗性前列腺癌(CRPC)的一個(gè)重要的新的治療選擇,臨床上與潑尼松聯(lián)用治療既往用含DTX治療方案的激素難治性轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者[3]。

紫杉烷類藥物其水溶性較低(約1～10 μg/mL),因此,臨床上所使用的Taxol?和Taxotere?均需要分別使用表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)和聚山梨醇80(吐溫80)，以及助溶劑乙醇來達(dá)到溶解藥物的目的。聚氧乙烯蓖麻油已被證明會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng)、神經(jīng)毒性、腎毒性和低血壓等。此外,聚氧乙烯蓖麻油還可在血液中形成微小顆粒包裹紫杉醇分子,影響藥物分子向組織間擴(kuò)散,降低抗腫瘤效果。吐溫80的使用易引發(fā)病人嚴(yán)重的過敏反應(yīng),在化療前,病人往往需預(yù)先服用或注射抗過敏藥物(皮質(zhì)類激素和H2受體拮抗劑),在輸液過程中,還需連接微孔過濾器以防止藥物在稀釋過程中產(chǎn)生的結(jié)晶微粒進(jìn)入病人血液循環(huán)系統(tǒng),這些均給臨床應(yīng)用帶來極大的風(fēng)險(xiǎn)和不便[4-5]。

為消除現(xiàn)有紫杉烷類藥物劑型的不良反應(yīng),增加紫杉烷藥物的溶解度、穩(wěn)定性,降低毒性,國內(nèi)外研究者展開了大量紫杉烷類藥物新劑型的研究,包括環(huán)糊精包合物、膠束、脂質(zhì)體、白蛋白等。這些新劑型雖然從一定程度上改善了現(xiàn)有制劑的不足,但均存在各自的缺陷,如:環(huán)糊精本身存在極高的腎毒性，脂質(zhì)體制劑包封率低、不穩(wěn)定、易泄露等，白蛋白紫杉醇制備工藝復(fù)雜等[6]。這些難以克服的缺陷限制了上述新型制劑的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和試劑臨床應(yīng)用。因此，有必要開發(fā)新的紫杉烷類藥物遞送系統(tǒng)。在新劑型中，納米載藥體系就是其中的熱點(diǎn)之一[7-8]。納米材料由于其粒徑小、比表面積大,載藥量高,表面容易修飾,可以達(dá)到控制藥物的釋放,實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)循環(huán),增加穩(wěn)定性,提高藥物的靶向性的目的,從而也在一定程度上降低了藥物的耐藥性。

聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物(PEG-PDLLA)膠束由于其理想的增溶特性和EPR行為吸引了廣泛關(guān)注。韓國Samyang公司的Genexol PM是以PEG-PDLLA為材料的紫杉醇聚合物,體外和動(dòng)物體內(nèi)的生物相溶性較好,未見明顯毒性,紫杉醇同位素體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)表明,膠束進(jìn)入體內(nèi)后迅速解離,釋放藥物,聚合物在體內(nèi)可以在15 h內(nèi)降解。Genexol PM于2002年由FDA(food and drug administration,食品藥品監(jiān)督管理局)批準(zhǔn)進(jìn)入臨床研究。Genexol PM膠束制劑已在韓國上市,也在美國進(jìn)入了臨床Ⅱ期。與其他的納米制劑相比,聚合物膠束具有強(qiáng)大的增溶能力,如紫杉醇,其固有溶解度約為1 μg/mL,制成脂質(zhì)體可增溶到3.4 mg/mL;而聚合物膠束的增溶能力則可達(dá)到10 mg/mL以上,藥載比可達(dá)到25%以上;此外,制得的聚合物膠束可過濾除菌,進(jìn)一步制成凍干粉制劑,在儲(chǔ)存時(shí)間和易用性方面將得到提升[9-10]。

本研究以PEG-PDLLA為載體,采用乳化-溶劑蒸發(fā)法,成功制備了分別載PTX、DTX和CBT的納米粒。本研究對(duì)3種紫杉烷類藥物進(jìn)行了評(píng)價(jià),通過改變載體與藥物的比例,以期得到更好的劑型。通過激光粒度儀、液相色譜等儀器表征納米粒的形貌和釋藥性能，通過模擬體外釋放表征納米粒的包封率與載藥量[11-12]，通過體外細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)、細(xì)胞攝取數(shù)據(jù)表征納米粒的體外抗腫瘤性能[13-14]。希望通過一系列的實(shí)驗(yàn)得到比較好的制備工藝和比較全面的體內(nèi)外數(shù)據(jù),為納米?？鼓[瘤制劑的開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)支持。

1材料與儀器

PEG2000-PDLLA2000(濟(jì)南岱罡生物工程有限公司)，PTX、DTX、CBT(純度≥98%,上海龍翔生物醫(yī)藥開發(fā)有限公司)，噻唑藍(lán)(MTT)(美國Gibco公司)，乙腈(HPLC級(jí),Honeywell),其他試劑均為分析純;人胃癌細(xì)胞(MGC-803)和HeLa(人宮頸癌細(xì)胞)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

Zetasizer Nano ZS ZEN3600(英國Malvern公司)，高效液相色譜LC-20A(島津科技有限公司)，恒溫震蕩箱HZ-9610KB(太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀MK3(美國Thermo公司)，CO2孵箱2406-2(上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司)，透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量14 000,上海源聚生物有限公司)。

2方法

2.1　載藥納米粒的制備

稱取紫杉醇2 mg,按1∶10比例稱取PEG2000-PDLLA200020 mg,溶解于2 mL乙腈中,超聲處理15 min,在60 ℃、20 r/min的條件下減壓蒸餾,蒸干溶劑后容器底部形成透明膠狀基質(zhì)。向基質(zhì)中加入10 mL蒸餾水,在60 ℃條件下使基質(zhì)溶化,得透明膠束溶液[15]。

用1∶20、1∶40的比例,即分別加入PEG2000-PDLLA200040、80 mg,其他條件不變,制備納米粒。再以多烯紫杉醇和卡巴他賽為原料,根據(jù)上述方法分別進(jìn)行操作,共9組。

2.2　載藥納米粒的表征

用Zetasizer Nano分析儀測(cè)定納米粒的平均粒徑(DLS)、粒徑分布(用多分散系數(shù)表示,PDI)及其Zeta電位(Zeta potential)。

2.3　載藥量及包封率的測(cè)定

將制備的納米粒先在2 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,取上清液在10 000 r/min、4 ℃條件下離心30 min,將離心得到的沉淀加高純水重新溶解,然后取適量的復(fù)溶待測(cè)液加同等體積的乙腈超聲5 min破乳,將制備的初始納米粒和破乳得到的待測(cè)液分別取20 μL注入液相色譜柱,測(cè)量紫杉醇的質(zhì)量濃度。進(jìn)而根據(jù)以下公式求得包封率(encapsulation efficiency, EE)和載藥量(drug loading capacity, DL) :

取一定量的載藥納米粒溶液,加入適量乙腈溶解材料,采用HPLC法測(cè)定納米粒中紫杉烷類藥物的含量。色譜條件如下:紫杉醇，用Hypersil ODS2 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動(dòng)相為乙腈∶水(50∶50,體積比)，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。多西他賽，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm,其他與紫杉醇條件相同。卡巴他賽，流動(dòng)相為乙腈∶水(60∶40,體積比);檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm,其他與紫杉醇條件相同。

2.4　載藥納米粒的體外釋放性質(zhì)研究

采用動(dòng)態(tài)透析法考察載藥納米粒的體外釋放特征,以吐溫-80(0.2%)-PBS(pH7.4)為釋放介質(zhì),精密吸取用蒸餾水溶解的納米粒分散液0.5 mL(含藥約1.0 mg),將其稀釋到10 mL;取1 mL作為零點(diǎn),其余的放到透析袋中(截留相對(duì)分子質(zhì)量14 000);取50 mL PBS加入吐溫-80至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%;將透析袋放在50 mL PBS的燒杯中,用保鮮膜封好,再用錫箔紙包好;在100 r/min、(37±0.5)℃條件下的搖床中進(jìn)行體外釋放試驗(yàn),分別于1、2、4、8、12、24 h取1 mL透析介質(zhì),同時(shí)向透析介質(zhì)中補(bǔ)充1 mL的空白釋放介質(zhì)。向取出的1 mL待測(cè)液中加入1 mL乙腈,渦旋混合均勻;按照HPLC法檢測(cè)各取樣點(diǎn)中紫杉烷類藥物的含量,計(jì)算不同時(shí)間的累積釋放百分率(release rate),制作釋放曲線。

式中：ct—各取樣點(diǎn)中紫杉醇的含量;V0—釋放介質(zhì)體積;V—取樣體積;M0—釋放介質(zhì)中的紫杉醇總量。

2.5　體外抗腫瘤活性

將人宮頸癌HeLa細(xì)胞株以含10%胎牛血清的RPM-I1640(含青霉素100 U/mL和鏈霉素100 mg/L),在37 ℃、5%的CO2孵育箱中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

將胃癌MGC803細(xì)胞以含有56 ℃、30 min滅活后的10%胎牛血清和12 U/mL慶大霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),在37 ℃、5%的CO2孵育箱中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

用胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,稀釋細(xì)胞至(5~10)×104個(gè)/mL。以0.1 mL/孔鋪96孔板,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。吸出培養(yǎng)液,將載藥納米粒用培養(yǎng)液調(diào)整到不同質(zhì)量濃度,分別加入到96孔板中(設(shè)空白組和對(duì)照組),每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。48 h后每孔中加入30 μL的MTT溶液繼續(xù)孵育4 h。待MTT與細(xì)胞反應(yīng)形成紫色結(jié)晶后,輕輕吸去上清,加入150 μL的DMSO溶液,低速振蕩反應(yīng)10 min,溶出胞內(nèi)紫色結(jié)晶。在酶標(biāo)儀上于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值,按照下式計(jì)算細(xì)胞存活率(cell viability):

3結(jié)果與討論

3.1　原藥差異及載體用量對(duì)納米粒的影響

考察PEG-PDLLA的用量對(duì)納米粒的影響,結(jié)果如表1所示。

表1　原藥差異及載體用量對(duì)載藥納米粒的影響

紫杉醇納米粒的DLS為(13±1)nm。在10∶1的條件下,PDI較大,分散均一性不夠好,而在20∶1與40∶1的條件下,PDI為0.18左右,粒徑大小與分布基本均勻。包封率在50%左右,且2號(hào)最高,達(dá)到56.28%。2號(hào)配方最好。

多西他賽納米粒的DLS為(13±1)nm。隨著載體用量增加,DLS減小,PDI更大,說明分散性反而不好。包封率在20%~30%之間,且5號(hào)最高。但PEG-PDLLA對(duì)多西他賽的包封效果不理想。5號(hào)配方最好。

卡巴他賽納米粒的DLS為(13±1)nm。其中,在10∶1的條件下,PDI很大,分散均一性不好,而在20∶1與40∶1的條件下,PDI為0.73左右,穩(wěn)定性稍有改善,但還是偏大。包封率在50%以上,且7號(hào)和8號(hào)均達(dá)到了60%以上。8號(hào)配方最好。

圖1　載藥PEG-PDLLA納米粒釋放曲線Fig.1　Release curves of drug loadedPEG-PDLLA nanoparticle

綜上,PEG-PDLLA用量是影響紫杉烷類納米粒的質(zhì)量和制備工藝的重要因素。一般情況下,PEG-PDLLA用量增大,藥物收率和包封率亦增大,趨于平衡;載藥量隨PEG-PDLLA用量的增大而降低。綜合考慮,PEG-PDLLA的用量不宜過大或過小。分析可知,3種最優(yōu)配方都是在載體與藥物用量比為20∶1時(shí),因此,20∶1為最佳載體用量。紫杉烷類藥物的種類在納米粒的形成過程中起重要作用,紫杉烷類的內(nèi)在性質(zhì)直接影響到納米粒的形成。3種藥物的平均粒徑接近,都為(13±1)nm。紫杉醇的均一性最好,卡巴他賽的包封率最高,達(dá)到61.95%。Zeta電位都在±5 mV內(nèi),在此范圍內(nèi),生物相容性較好。

3.2　載藥納米粒的體外釋放行為

為了顯示釋放效果,選用市場(chǎng)上銷售的紫杉醇注射劑Taxol?、多西他賽注射劑Taxotere?和多卡巴他賽注射劑Jevana?作為比照。Taxol?的釋放速率較快,24 h釋放73.1%,3號(hào)釋放最多,達(dá)到52.23%,3種納米粒與其開始階段的釋放現(xiàn)象相似,都具有緩慢釋放的特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)制備的納米粒具有較好的緩釋效果,可以長(zhǎng)期起到作用,但在釋放量上Taxol?占有優(yōu)勢(shì)。對(duì)比3種納米粒,發(fā)現(xiàn)載體用量越多,釋放度越大。3種多西他賽納米粒與Taxotere?的釋放速率及釋放度都相近,具有緩慢釋放的特性。Taxotere?最大釋放量達(dá)到88.65%,5號(hào)釋放最多,達(dá)到75.00%。3種卡巴他賽納米粒與Jevana?的釋放速率及釋放度都相近,且在10∶1與20∶1的條件下制備的納米粒釋放度比Jevana?更大,20∶1時(shí)釋放度最大,達(dá)到85.50%(圖1)。結(jié)果表明,本研究制備的納米粒具有較好的緩釋效果,可以長(zhǎng)期起到作用。

3.3　載紫杉烷類藥物納米粒的體外抑瘤活性

用MTT法研究了臨床應(yīng)用的注射劑,載紫杉烷類藥物納米粒的體外抑瘤活性,結(jié)果見圖2~圖4。

隨著納米粒中PTX質(zhì)量濃度的增加,MGC-803與HeLa細(xì)胞存活率有明顯下降,但效果并不如Taxol?。且載體與PTX的質(zhì)量比為20∶1時(shí),抑瘤效果最好。從圖3可以看出,隨著納米粒中DTX質(zhì)量濃度的增加,細(xì)胞存活率有明顯下降,但效果與Taxotere?相似。3種配方抑瘤效果相當(dāng)。隨著納米粒中DTX質(zhì)量濃度的增加,細(xì)胞存活率有明顯下降,但效果與Jevana?相似,且載體與CBT的質(zhì)量比為20∶1時(shí)效果最好。

圖2　PTX納米粒質(zhì)量濃度與MGC-803細(xì)胞、HeLa細(xì)胞存活率的關(guān)系Fig.2　In-vitro cytotoxicity of PEG-PDLLA in nanoparticle containing PTX at various concentrations(0.01-100 μg/mL) against MGC-803 and HeLa cancer cells at 48 h

圖3　DTX納米粒質(zhì)量濃度與MGC-803細(xì)胞和HeLa細(xì)胞存活率的關(guān)系Fig.3　In vitro cytotoxicity of PEG-PDLLA in nanoparticle containing DTX at various concentrations(0.01-100 μg/mL) against MGC-803 and HeLa cancer cells at 48 h

圖4　CBT納米粒質(zhì)量濃度與MGC-803細(xì)胞和HeLa細(xì)胞存活率的關(guān)系Fig.4　In vitro cytotoxicity of PEG-PDLLA in nanoparticle containing CBT at various concentrations(0.01-100 μg/mL) against MGC-803 and HeLa cancer cells at 48 h

4結(jié)論

為了解決紫杉醇的溶解性,降低毒副作用,本研究采用生物可降解材料PEG-PDLLA,研究了影響納米粒形成和藥物包封的主要因素,通過體外細(xì)胞毒性和細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，考察了制備納米粒的體外抗腫瘤活性。本研究主要得出如下結(jié)論:

1)PEG-PDLLA用量是影響紫杉烷類納米粒的質(zhì)量和制備工藝的重要因素。一般情況下,PEG-PDLLA用量增大,載藥量隨載體用量的增大而降低,但藥物包封率增大,即包封效果好,納米粒中藥物釋放的有效濃度增大。但當(dāng)載體用量達(dá)到質(zhì)量比40∶1時(shí),穩(wěn)定性與包封率也不一定高。綜合考慮,PEG-PDLLA的用量不宜過大或過小,以20∶1為宜。

2)紫杉烷類藥物的種類在納米粒的形成過程中起重要作用,紫杉烷類的內(nèi)在性質(zhì)直接影響到納米粒的形成。3種藥物的平均粒徑接近,都為(13±1)nm,粒徑分布也較集中,可滿足納米粒載藥體系的要求。紫杉醇的均一性最好,卡巴他賽的包封率最高。

3)載藥納米粒中藥物均有一定程度的比較弱的突然釋放,因此這些納米粒具有較好的緩釋作用。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),紫杉烷類藥物釋放速率慢慢降低,由于聚合物在室溫中性溶液中降解速度的緩慢,藥物的累積釋放率也增加緩慢。載紫杉醇與多烯紫杉醇納米粒的釋放效果與市售藥物相近,載卡巴他賽納米粒的釋放效果比市售藥物更好。

4)載紫杉烷類藥物納米?？商岣咚幬锏纳锢枚?包封于納米粒后其活性沒有降低,而且可以從納米粒中逐漸釋放出來而在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)作用于癌細(xì)胞。另外,采用載紫杉醇納米粒的形式給藥,無需使用對(duì)人體有不良副作用的Cremophor EL等,更加有益于其臨床應(yīng)用。細(xì)胞存活率明顯下降,與市售藥物效果相近。

5)以PEG-PDLLA為載體包載紫杉烷類藥物,并嘗試通過改變載體用量來改善其溶解性的思路可行,但還需要更多的嘗試。

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Preparation and in-vitro evaluation of PEG-PDLLA

in nanoparticle containing taxanes

WEI Wei1,2, ZHANG Yingxin3, ZHANG Xiaomin3, JIANG Chengjun1,2, ZHOU Yifeng1,2

(1.School of Biological and Chemical Engineering, Zhejiang University of Science and Technology,

Hangzhou 310023, China; 2.Zhejiang Provincial Key Laboratory for Chemical and Biological

Processing Technology of Farm Produce, Hangzhou 310023, China;

3.Pushikang Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou 310021, China)

Abstract:PEG-PDLLA in nanoparticle containing taxanes was prepared by emulsion solvent evaporation method. The particle size and Zeta potential were evaluated by Malvern Zerta sizer. The encapsulation efficiency and drug-loading content were examined by HPLC method. The kinetics of taxanes released from the nanoparticle in phosphate buffer solution (PBS) was studied. The uptake and cell toxicity of drug-loading nanoparticle in MGC803 and HeLa were preliminary evaluated. The result showed that the particle size is (13±1) nm, and distribution is concentrated. The ratio of the carrier and the drug is preferably 20∶1. The homogeneity of taxol is best, and encapsulation efficiency of cabazitaxel is highest, reach 88.77%. The nanoparticle with drug has a better sustained release. Survival of cancer cells in vitro anti-tumor decreased with similar clinical results with injections.The nature, release, and cell inhibition rate of PEG-PDLLA in nanoparticle containing taxanes is good.The test provides an experimental basis for the development of novel taxanes intravenous formulations.

Key words:taxanes; PEG-PDLLA; nanoparticle; in-vitro evaluation; cytotoxicity

中圖分類號(hào):R979.1;R965

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1671-8798(2015)01-0015-07

通信作者:蔣成君,高級(jí)工程師,博士,主要從事制藥工程研究。

作者簡(jiǎn)介:魏煒(1992—),女,浙江省嵊州人,碩士研究生,研究方向?yàn)樗幬镏苿?/p>

基金項(xiàng)目:中國博士后科學(xué) (2014M551745)

收稿日期:2014-10-11

doi:10.3969/j.issn.1671-8798.2015.01.004