孫會玲，王杏娣，陳慶國，劉 梅，孫靜亞，魏榕飛，徐慶達

（1.浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江國際海運職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316021）

固定化微生物對海洋溢油的修復(fù)研究

孫會玲1，王杏娣2，陳慶國1，劉 梅1，孫靜亞1，魏榕飛1，徐慶達1

（1.浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江國際海運職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316021）

溢油對海洋生態(tài)環(huán)境和海洋資源都有長期的危害，溢油污染已經(jīng)成為人們必須面對的重大環(huán)境問題。微生物修復(fù)技術(shù)可以處理物理方法和化學(xué)方法無法清除的殘余溢油是恢復(fù)生態(tài)環(huán)境的最佳途徑。固定化技術(shù)與微生物結(jié)合，能夠保持微生物高密度、高活性，增強其環(huán)境耐受性，提高其降解石油烴的效率，得到了研究者的重視。本文介紹了固定化材料和方法，降解石油烴的微生物的種群，綜述了固定化細菌、真菌、微藻在海水、灘涂溢油修復(fù)中的研究進展，菌藻組合的優(yōu)勢及在石油烴降解修復(fù)中的應(yīng)用，并對其發(fā)展方向進行了展望。

溢油；微生物；固定化；生物修復(fù)

原油及衍生品在全球的使用和分布對海洋環(huán)境造成了極大的潛在危害[1]。海上油田的井噴、油船的泄露等都會對海洋造成嚴(yán)重且持久的污染。微生物修復(fù)技術(shù)[2]，采用該技術(shù)可以處理物理和化學(xué)方法無法清除的溢油，而且其成本低、環(huán)境友好且不產(chǎn)生二次污染，被認為是恢復(fù)生態(tài)環(huán)境的最佳途徑[3-5]。

固定化微生物具有細胞濃度高、反應(yīng)速度快、微生物流失少、產(chǎn)物易分離等優(yōu)點[6]，且固定化微生物對pH值、鹽度的適應(yīng)性更強、對環(huán)境的耐受性也有所增強、對石油烴的降解率要高[7]。因此，用固定化微生物對海洋溢油的修復(fù)越來越受到研究者的親睞。

本文介紹了固定化材料和方法，降解石油烴的微生物的種群，綜述了固定化細菌、真菌、微藻在海水、灘涂溢油修復(fù)中的研究進展，菌藻組合的優(yōu)勢及在石油烴降解修復(fù)中的應(yīng)用，并對其發(fā)展方向進行了展望。

1 微生物的固定化材料與方法

1.1 微生物的固定化材料

固定化載體的作用不僅是將微生物固定，以防微生物被沖淡；而且其表面可以促進生物膜的自然形成[8]。此外，固定化載體還應(yīng)該廉價易得，對環(huán)境不產(chǎn)生污染。

固定化載體主要包括無機載體、有機高分子載體和由此兩者組成的復(fù)合載體，其中有機高分子包括天然有機高分子和合成有機高分子[9]。BAI等[10]用碳酸鈣和PVA制成了一種新的固定微生物的復(fù)合載體。

隨著對載體研究的深入，研究者把目光轉(zhuǎn)向了不僅吸附性好、且價格低廉、來源豐富的天然材料[11-14]，如貽貝殼、貝殼砂等。

1.2 微生物的固定化方法

微生物的固定化方法有包埋法[15-18]、吸附法[19]、交聯(lián)法[10]以及共價結(jié)合法，大多數(shù)固定化采用包埋法。

用包埋法將細菌固定在載體上，固定后其形狀多為微球，且張秀霞[20]等研究表明球形載體比片形載體的固定化菌降解效率要高，這可能是因為球形與原油的接觸面積大，有利于細菌降解石油烴。包木太等[15]用包埋法將細菌固定在海藻酸鈉-氯化鈣載體中，活性炭的添加增強了載體的傳質(zhì)性和機械強度，使得固定化菌可以更好吸收外界進行營養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧。固定化菌對原油的降解率比游離態(tài)菌提高了20%。

2 石油烴降解微生物研究

能夠降解海洋石油污染物的微生物有細菌、真菌、微藻等200多種，分屬于70個屬，其中細菌種群最為眾多，有約40個屬[3]。表1中列出了部分利用微生物處理石油烴的研究進展。

利用細菌降解油污的研究開始于20世紀(jì)40年代[4]，起步較早，因而對細菌降解機理研究[31-33]較多較深入。細菌將石油烴作為碳源和能源，對烴類化合物代謝的關(guān)鍵步驟是底物被氧化酶氧化的過程，此過程需要分子氧參與[34]。當(dāng)海上發(fā)生溢油時，石油烴降解菌會大量繁殖，此時碳源充足，但氧和營養(yǎng)鹽供應(yīng)不足會限制石油烴的降解。所以為促進細菌降解石油烴往往會向被污染的海域投入氮磷營養(yǎng)鹽[35]。

輕油和中油會在海水表面迅速的擴散，形成厚度為100 μm或者更薄的油膜[36]，使其處理困難。而真菌的菌絲會將石油聚集成團[37]，通過物理收集即可除去石油和菌絲，達到去除油膜的目的。林鳳翱等[28]從海洋中分離出了4株降解石油烴絲狀真菌，2株青霉菌，另外2株分別為曲霉菌和鐮刀菌。將這4株石油烴降解真菌與石油烴降解菌比較，真菌降解石油烴的速率為2.00×10-9～1.70×10-7mg/(cell·h)，是石油烴降解菌降解速率數(shù)百倍或數(shù)萬倍。而且這4株真菌降解石油烴時不需要添加氮磷等營養(yǎng)鹽。ZINJARDE等[38]從孟買港被原油污染的海水和沉積物分離出11種細菌和6種酵母菌。在溫度為30℃、原油含量為0.5%時，6種酵母菌中的Yarrowia lipolytica對脂肪烴含量較高的原油降解率最高可達80%。然而，將固定的真菌來處理海洋溢油的研究還未見報道。

表1 降解石油烴微生物的研究進展Tab.1 Research progress of microorganism degradating petroleum hydrocarbons

自1953年，一些微藻被發(fā)現(xiàn)能利用有機物作為唯一碳源和能源進行異養(yǎng)生長，培養(yǎng)異養(yǎng)微藻的研究就此拉開序幕[39]。微藻可以異養(yǎng)降解石油烴是微藻能在溢油污染的情況下生長的原因[40]。梁譯之[30]等以微藻內(nèi)脂肪含量為指標(biāo)研究海水小球藻和鹽生杜氏藻對帶共軛雙鍵的烴類化合物和芳烴的降解效果。當(dāng)石油濃度為3.5 μg/mL時，這兩種微藻對帶共軛雙鍵的烴類化合物和芳烴的降解效果最好。

固定化技術(shù)與微生物結(jié)合，在克服微生物流失快等缺點的同時，還可以提高其對環(huán)境的耐受性，使其可應(yīng)用范圍擴大。

3 固定化細菌在海洋溢油中的應(yīng)用

當(dāng)海上發(fā)生溢油事故時，大部分油品可以通過物理方法回收，剩下的部分依然暴露在海洋環(huán)境中，海底沉積物是其最終的匯[41]。HII等[42]研究了石油烴降解菌群對海底沉積物中石油烴的分解情況。當(dāng)溢油發(fā)生在港口時，岸灘也會被石油烴污染。本部分從海水和岸灘二方面綜述了固定化細菌在海洋溢油中的應(yīng)用。

3.1 固定化細菌在處理海水中石油烴的應(yīng)用

QUEK等[33]用聚氨酯泡沫固定石油烴降解菌Rhodococcus sp.F92降解石油烴，聚氨酯泡沫對該菌的吸附率可達109個/cm。溫度為30℃，7 d后顯示無論是游離態(tài)的還是固定態(tài)的F92對總烷烴的降解率都將近90%。

GENTILI等[43]用從蝦的廢棄物中提取了甲殼素和殼聚糖為載體固定石油烴降解菌Rhodococcus corynebacterioides。15 d后，試驗結(jié)果顯示，以甲殼素為固定化載體的對石油烴的效果最好，石油烴降解率為60%。

李馨子等[44]用海藻酸鈉包埋海洋石油烴降解菌Alcanivorax sp.97CO-5降解石油烴，并在14 d后對實驗結(jié)果進行了測定。結(jié)果表明，固定化菌劑對石油的降解率為34.1%。對石油中總烷烴降解率為57.9%，對石油中的芴和二苯并噻吩兩類烷基化多環(huán)芳烴的降解率分別達到了44.9%和44.2%。

3.2 固定化細菌在岸灘溢油污染處理中的應(yīng)用

TSUTSUMI等[45]用泰然酶（TerraZyme）固定石油烴降解菌在納霍德卡岸進行了現(xiàn)場試驗。試驗開始前，實驗組區(qū)域石油覆蓋率為91.0%±6.6%，對照組為87.0%±8.2%。八周后，實驗組區(qū)域石油覆蓋率降低到13.7%±8.2%，對照組為51.0%±16.1%，可見，實驗組區(qū)域比對照組區(qū)域的石油覆蓋率明顯降低。

鄭立等[46]基于石油烴降解菌群DC10研制成降解菌劑應(yīng)用于在大連溢油污染岸灘進行修復(fù)研究。結(jié)果表明，12 d的潮間帶修復(fù)試驗中，實驗組相對于對照組總烷烴和總芳香烴降解率分別提高了80%和72%。86 d潮上帶修復(fù)試驗中，實驗組對總烷烴和總芳香烴比對照組分別提高30%和20%。

4 固定化菌藻在石油烴降解中的應(yīng)用

微藻中有幾種可以降解烴類[47]，然而，目前僅少量報道研究固定微藻降解石油烴[40]。SUZUKI等[40]將Prototheca zopfii固定在海藻酸鈣微粒上，比較了固定藻和游離藻以及固定藻和一些已知的石油烴降解細菌。實驗結(jié)果顯示，固定藻和游離藻都可以很好的降解石油烴，雖然固定藻的第一個降解周期要長于游離藻，但是固定藻降解石油烴重現(xiàn)性要比游離藻高；且固定藻的石油烴降解率高于實驗對照的石油烴降解菌。

唐霞[48]研究了藻-菌體系降解原油性能，發(fā)現(xiàn)從石油污染水體中分離得到的天然顫藻-附生菌體系和人工構(gòu)建的純斜生柵藻-石油組分降解菌體系對初始濃度為3%的原油的主要成分有高效的去除作用。但菌藻之間的相互作用機制仍不明確。MCGENITY等[49]認為微生物降解石油并不是某種特定的微生物在起作用，而是細菌、真菌和微藻之間的共同作用。微藻的藻際微環(huán)境中有著大量的異養(yǎng)型的細菌，微藻和細菌間必然存在著互利關(guān)系，微藻為細菌提供碳源和能源，細菌提供鐵、紅血素、維生素B12，并消耗氧氣以保護微藻對抗活性氧簇。微藻和細菌之間的關(guān)系對石油烴的降解有著非常重要的作用。許多藻類都可以產(chǎn)生可揮發(fā)性的烴類，使得石油烴降解菌群在沒有溢油的時候得以維持。這就解釋了通常在微藻或者大型藻發(fā)現(xiàn)食烷菌的原因。而烴類的存在也許加強了微藻和細菌之間的關(guān)系。例如，微藻釋放的氧氣對于活化烴類非常重要，且氧氣可以作為有氧呼吸的電子接收體。另一方面，異養(yǎng)細菌使得微藻周圍局部的二氧化碳濃度增高，進一步加強了光合作用。微藻產(chǎn)生的有機化合物也可能在不同程度上影響烴類的降解。

周瑜[36]等比較了單獨培養(yǎng)時的菌株和用微藻共培養(yǎng)菌株的降解率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與微藻共培養(yǎng)后，部分菌株的降解率有所提升。此研究為菌藻降解石油烴提供了又一支持。目前，固定化菌藻大多用于處理廢水中的氮磷[50-52]。好氧細菌在氧的充足條件下可更好的降解石油烴[4]，微藻光合作用產(chǎn)生的氧氣比人工充氧更能被細菌有效利用[53]。菌藻組合，并使之固定化，在處理海洋溢油中會具有極大的應(yīng)用潛力。

5 展望

基于固定化微生物的在海洋溢油修復(fù)的優(yōu)勢，可以從以下方面繼續(xù)開展研究：

（1）微生物中關(guān)于真菌降解海洋中石油烴的研究較少，篩選分離更多石油烴降解真菌將其固定化后用于海洋溢油的處理成為一個研究開展方向。

（2）尋找更多的可降解石油烴的微藻，進一步研究微藻降解石油烴的機理。重點研究異養(yǎng)微藻降解石油烴，這樣微藻不僅處理了溢油污染，還可以制備生物柴油。

（3）開展固定化藻菌在處理海洋溢油方面的研究。結(jié)合微藻和細菌在降解石油烴的優(yōu)勢，固定化藻菌在處理海洋溢油中會有巨大的潛力。

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Study on Application of Immobilized Microorganism in Marine Oil Spill Bioremediation

SUN Hui-ling1,WANG Xing-di2,CHEN Qing-guo1,et al
(1.Marine Science&Technology School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022; 2.Zhejiang International Maritime College,Zhoushan 316021,China)

Marine oil spill can hazard marine ecological environment and resource for a long times,and it becomes a serious environmental problem.Microorganism remediation is the best way to deal with the residual oil which is failed to be cleaned up by the physical and chemical methods.Combining immobilized technology and microorganism attracted many researchers’eyes,for its advantage of high density and high activity of microorganism,and more tolerance to environment,which could improve the efficiency of petroleum hydrocarbons degradation.In this paper,materials and methods of immobilized technology and species of microorganism degrading petroleum hydrocarbons were introduced,the progress of the utilization of immobilized bacteria,fungus and micro-algae in remediation of seawater and shore oil spill was reviewed and the advantages of immobilized algae-bacteria and its application in remediation of marine oil spill were summarized.Finally,an outlook on the development of microorganism immobilized in remediation of marine oil spill was introduced.

oil spill;microorganism;immobilized;bioremediation

X55

A

1008－830X(2015)06－0565－06

2014-07-30

浙江省自然科學(xué)基金（LQ13D060001；LY14D060003）；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃項目（2013R411042）

孫會玲（1989-），女，河北承德人，碩士研究生，研究方向：海洋溢油生物修復(fù).E-mail:226545932@qq.com

陳慶國（1984-），男，博士，講師，研究方向：海洋生態(tài)污染修復(fù).E-mail:qgchen@zjou.edu.cn