朱敬萍，胡紅美，張小軍，顧蓓喬，梅光明，嚴(yán)忠雍

（1.浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021）

海水中亞硝酸鹽和硝酸鹽是無機(jī)氮的主要存在形式，是一種重要生源要素，也是引起近岸海域水體富營養(yǎng)化的主要因素，其含量為海洋科學(xué)研究中的一項(xiàng)基本數(shù)據(jù)。目前，硝酸鹽和亞硝酸鹽的測定方法有很多[1-3]，如紫外可見分光光度法[4-5]、高效液相色譜法[6-7]、毛細(xì)管電泳法[8]、離子色譜法[9]、離子選擇電極法[10]、流動注射法[11-16]等。分光光度法操作步驟冗長、繁瑣耗時又耗化學(xué)試劑，不能滿足批量樣品的快速測定，難以對水體進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測；離子選擇電極法儀器設(shè)備簡單，且能進(jìn)行連續(xù)快速測定，但靈敏度較低；其他方法其儀器昂貴，實(shí)驗(yàn)成本較高，在進(jìn)行大批量樣品測試時顯得費(fèi)時費(fèi)力和增加成本，并且對環(huán)境造成一定的污染。近年來連續(xù)流動注射技術(shù)被越來越多地應(yīng)用于海水中營養(yǎng)鹽的分析，AA3流動注射儀以其模塊化設(shè)計(jì)，具有自動進(jìn)樣、分析速度快、直接輸出樣品濃度而不需以吸光度轉(zhuǎn)換、測定成本低等優(yōu)點(diǎn)，正在日益得到推廣。本文運(yùn)用SEAL Analytical AA3流動注射分析儀，同時測定海水中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，可在1 h內(nèi)完成60個樣品中這兩個參數(shù)的連續(xù)測定，并能按照各種形式表達(dá)輸出檢測結(jié)果，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與預(yù)處理

分別于2014年2月、5月、8月、11月四個季度，在長江口、杭州灣、舟山漁場等海域各進(jìn)行一次海水樣品的采集，水樣帶回實(shí)驗(yàn)室后，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后貯于聚乙烯瓶中保存?zhèn)溆?。?yīng)從速分析，如不能從速分析，需放置冷藏室保存。

1.2 方法原理

硝酸鹽測定原理[21]：在銅的催化作用下，硝酸鹽被鎘圈還原成亞硝酸鹽，并和對氨基苯磺酰胺及鹽酸萘乙二胺(NEDD)反應(yīng)生成粉紅色化合物在550 nm波長下檢測。

通常情況下，水和海水中氧化劑和還原劑的濃度及金屬離子的濃度都很低，不足以引起干擾。如果金屬離子濃度高，會使得測量值偏大，如二價(jià)汞和二價(jià)銅會形成有顏色的絡(luò)合離子，增加光的吸收。硫化物，硫酸鹽和有機(jī)物，尤其是油，會影響鎘圈的還原能力，產(chǎn)生干擾。含有這些物質(zhì)的樣品在測定前必須預(yù)處理。該方法也適用于過硫酸鹽消化后樣品的測定。樣品通過鍍銅的鎘圈還原，在緩沖溶液中硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽。其吸光值與樣品中的亞硝酸鹽+硝酸鹽濃度呈線性關(guān)系。硝酸鹽濃度通過從亞硝酸鹽+硝酸鹽濃度中減去亞硝酸鹽濃度獲得。

亞硝酸鹽測定方法原理：亞硝酸鹽在酸性條件下與對氨基苯磺酰胺反應(yīng)生成一個偶氮化合物，然后與萘乙二胺鹽酸（NEDD）反應(yīng)生成紫紅色化合物在550 nm波長下檢測。

亞硝酸鹽濃度是在沒有通過鎘柱的程序中測定的。本方法不存在明顯的鹽誤差。

1.3 主要儀器和試劑

BRAN+LUEBBE連續(xù)流動分析儀AutoAnalyzer3（德國布朗盧比公司）。LED光度計(jì)。實(shí)驗(yàn)室常用儀器和器皿。

硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲備液：100 mg/L-N(中國計(jì)量科學(xué)研究院，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))。配制成10.0 mg/L-N硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液。

咪唑緩沖液：6.0 g咪唑加入1.0 mL硫酸，用純水稀釋至1 000 mL冷藏。

顯色劑：將100 mL磷酸加入約700 mL純水中，加入10.0 g磺胺，完全溶解后，再加入0.50 g鹽酸萘乙二胺（NEDD）和4 mL Brij-35,30%溶液（活性劑），用純水稀釋至1000 mL，并混合均勻。試劑必須無色，儲存于棕色瓶中，冷藏。

亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲備液：100 mg/L-N(中國計(jì)量科學(xué)研究院，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))。配制成5.0 mg/L-N亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液。

顯色劑：與測定硝酸鹽使用的顯色劑相同。測定前所有試劑均需超聲脫氣。

所有試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水（18.2 MΩ·cm）。

1.4 儀器工作條件

儀器工作條件的設(shè)定見表1。

表1 儀器工作條件Tab.1 Working conditions of Instrument

啟動AA3流動分析儀，泵入純水至基線穩(wěn)定后，插上加熱池(37℃)電源，再泵入試劑到進(jìn)樣通道，達(dá)到試劑基線穩(wěn)定；測定樣品前，要先測一下標(biāo)準(zhǔn)曲線中標(biāo)準(zhǔn)濃度的最高點(diǎn)，最佳峰高為75%～95%之間，設(shè)定它的增益點(diǎn)。然后開始自動分析。實(shí)際操作中因該模塊中的硝酸鹽和亞硝酸鹽兩個通道同時運(yùn)行，故設(shè)置進(jìn)樣速率應(yīng)一致，均設(shè)置為60個/h。啟動工作程序,儀器自動取樣并進(jìn)行分析，分析全部完畢后電腦自動輸出各水樣和標(biāo)準(zhǔn)系列的濃度值。流動注射分析儀硝酸鹽和亞硝酸鹽分析模塊流路見圖1。

圖1 硝酸鹽和亞硝酸鹽分析模塊流路圖Fig.1 Analysis module flow chart of nitrate and nitrite

2 結(jié)果與討論

2.1 管路流通狀態(tài)對檢測靈敏度的影響

一般來說，我們可以把影響一個具體分析過程的因素分為兩大類，液流的流體狀態(tài)、顯色與檢測。AA3高性能的蠕動泵為液流的均勻、穩(wěn)定提供了保證，可以進(jìn)行準(zhǔn)確的流量控制和保證穩(wěn)定持續(xù)向前的推動力，可以有效地消除流體的脈動。泵、化學(xué)模塊、檢測器位于同一水平面上，沒有高度差，不會帶來壓降。此外，流體狀態(tài)還受空氣泡大小、形狀影響。空氣泡大小要合適，太大流速過快，進(jìn)入流通池中的流量相對減少；太小不能完全分割樣品，帶過增加。氣泡形狀要圓頭圓尾，否則管路中易產(chǎn)生負(fù)壓。此外，廢液管太長，或伸入廢液液面下也會產(chǎn)生負(fù)壓，導(dǎo)致亂峰和雜峰，影響線性；取樣針、試劑管路、接頭之間內(nèi)徑差異大，也會產(chǎn)生負(fù)壓。因此選擇最佳的管路對檢測靈敏度非常重要。

連續(xù)流動化學(xué)分析是采用并流技術(shù)，通過泵管定量吸取各種試劑與樣品，按照確定的比例關(guān)系，發(fā)生顯色反應(yīng)，按照朗伯比爾定律對樣品定量測定。加入空氣泡使樣品或標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分割，并使液流處于完全湍流狀態(tài)，確保提高測定過程的靈敏度。

2.2 鎘柱與鎘圈的優(yōu)化選擇

硝酸鹽的檢測通常需通過鎘柱來還原[11-12,17]，AA3流動分析儀的鎘柱需自己動手填裝，根據(jù)鎘顆粒和空隙的大小，可以通過使用不同的管子調(diào)節(jié)鎘的表面積。當(dāng)柱子的直徑是最大顆粒的兩倍時，分散率最低。需要調(diào)整管子的長度保證硝酸鹽可以被完全還原。管子太長或有死體積會引起高的帶過，且在反復(fù)檢測海水樣品過程中容易降低還原率，需重新填裝鎘柱和清洗并激活。但鎘有毒，由于填裝鎘柱操作時有許多不便，容易使皮膚接觸和吸入。因此本實(shí)驗(yàn)采用鎘圈代替鎘柱，鎘圈無需重新填裝，清洗、激活方便可行。此外，選擇鎘圈，可降低基線噪音和檢出限[15]。為更好地延長鎘圈的使用壽命，把分割片斷流的空氣替換為氮?dú)?。為穩(wěn)定隔圈，分析樣品前，分別泵入100 mg/L的硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲備液5 min，再泵入100 mg/L的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲備液10 min。等100 mg/L的硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液完全沖洗干凈后，再泵入標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度的硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液直到出現(xiàn)的峰平穩(wěn)（約10 min）。

2.3 試劑濃度的優(yōu)化選擇

為確保良好的重現(xiàn)性和低檢出限，保證反應(yīng)環(huán)境的小變化不會影響結(jié)果，需通過實(shí)驗(yàn)來調(diào)整試劑的濃度。測定硝酸鹽時，多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道采用氯化銨緩沖液，但試劑和溶液中活性氯與銨離子的來源均不穩(wěn)定，容易導(dǎo)致靈敏度降低、線性不好、背景值增大，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)氯化銨緩沖液改為咪唑緩沖液。30%的Brij-35溶液，使用時間太長易被氧化，會導(dǎo)致峰形不好、回收率下降，若將其加入咪唑緩沖液時對隔圈有損，會直接影響靈敏度和線性。因此，將30%的Brij-35溶液加入顯色劑溶液中，且測定亞硝酸鹽中的顯色劑與測定硝酸鹽中的顯色劑濃度相同，可以共用。顯色劑中磷酸用量對光電壓同樣影響很大，本實(shí)驗(yàn)在1 L顯色劑中分別加入磷酸50、60、70、80、90、100、110 mL，結(jié)果表明隨著磷酸用量的增加，吸光度值呈上升趨勢，100 mL時吸光度值達(dá)到最大，進(jìn)一步增加磷酸用量，吸光度值下降很快。因此，最終選用100 mL磷酸。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

分別取適量的硝酸鹽和亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別配制成硝酸鹽0.0～1.60 mg/L，亞硝酸鹽0.0～0.150 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別按照樣品分析的相同條件進(jìn)行自動進(jìn)樣分析，測得標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)三倍信噪比測得各分析物的檢測限。各組分的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)，檢出限見表2。

表2 本方法的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.2 Linear regression equation,correlation coefficient and detection limit(S/N=3)of the proposed method

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度分析

對國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品硝酸鹽GSBZ 50008-88和亞硝酸鹽GSBZ 50006-88，同時用分光光度法和流動注射法進(jìn)行6次平行測定，檢測結(jié)果見表3。

表3 國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品硝酸鹽和亞硝酸鹽測定結(jié)果Tab.3 Results of the national standard samples of nitrate and nitrite

由表3可知，分光光度法和流動注射法測定硝酸鹽和亞硝酸鹽準(zhǔn)物質(zhì)，均在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)，硝酸鹽分光光度法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.25%～1.38%之間，流動注射法測得的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.762%～0.821%之間，RSD<2%。亞硝酸鹽分光光度法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.06%～1.23%之間，流動注射法測得的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.23%～1.27%之間，RSD＜2%，由此可見分光光度法與流動注射法均具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，符合分析要求。

2.6 實(shí)際海水樣品分析及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化條件下反應(yīng)，按照實(shí)驗(yàn)方法測定硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，本文對長江口、杭州灣、舟山漁場等海域采集水樣，將水樣過濾后直接進(jìn)樣分析，平行測定6次，同時對各站位樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，分析結(jié)果見表4。

由表4可知，AA3流動注射分析儀測定海水中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，其加標(biāo)回收率分別在84.67%～101.2%之間和86.67%～100.0%之間；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在0.067%～5.27%和0.00%～4.35%，具有較好的準(zhǔn)確度。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均≤6.0%，根據(jù)《海洋監(jiān)測規(guī)范》要求RSD≤10%18]。結(jié)果表明，該方法有較好的精密度，符合國標(biāo)的檢測要求。

3 小結(jié)

本研究采用AA3流動注射分析儀同時測定海水中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，選擇最佳優(yōu)化條件，建立最佳測定方法。硝酸鹽和亞硝酸鹽分別在0.0～1.60 mg/L和0.0～0.150 mg/L內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。本方法具有靈敏度高、檢出限低、精密度和準(zhǔn)確度較好的特點(diǎn)，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均符合《海洋監(jiān)測規(guī)范》的要求。同時，本方法摒棄了傳統(tǒng)手工分析方法操作繁瑣、耗時、耗費(fèi)大量化學(xué)試劑、易引入人為誤差等弊端，實(shí)現(xiàn)了海水中硝酸鹽和亞硝酸鹽的自動化分析，提高了工作效率，降低了分析人員的工作強(qiáng)度，特別適合大批量的樣品分析，為海洋環(huán)境監(jiān)測工作者提供了一種可靠而簡便的水質(zhì)監(jiān)測方法。

表4 樣品分析結(jié)果Tab.4 Results of the samples

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