【摘要】結(jié)核病仍是嚴重威脅人類健康的傳染病之一，卡介苗(mycobacterium bovis bacillus calmette-guérin，BCG)是唯一被批準用于結(jié)核病預(yù)防的疫苗，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)其免疫保護效果極不穩(wěn)定，構(gòu)建重組BCG成為目前新型抗結(jié)核疫苗研究的重要方向之一。本文概括性地介紹了抗結(jié)核重組BCG疫苗研究的必要性、抗結(jié)核重組BCG的研究策略與研究進展以及存在的問題和未來展望。

【文章編號】1005-3697(2015) 05-0595-05

【文獻標志碼】A

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.05.05

基金項目:教育部重點項目(205138)

收稿日期: 2015－07－20

作者簡介:楊愛瓊(1970－)，女，四川渠縣人，主管藥師，主要從事分子基因藥物學(xué)研究。

通訊作者:謝勇恩，E-mail: cbyxye0369@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2015-10-26 17∶14

網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20151026.1714.010.html

Research progress of recombinant BCG vaccines against Mycobacterium tuberculosis

YANG Ai-qiong 1，XIE Yong-en 2

(1.Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College; 2.Institute of Molecular Biology，North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

【Abstract】Tuberculosis is still a severe infectious disease threatening human health.Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the only vaccine approved for prevention of tuberculosis.However，it was found that BCG had very unstable or variable protective effect against tuberculosis in recent years.Constructing recombinant BCG is one of the most promising areas in developing new anti-tuberculosis vaccine.This article summarizes the necessity，strategies，progress，problems and future prospect of the recombinant BCG study.

【Key words】Tubercolosis vaccine; Recombinant Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin; Immunogenicity; Protective immunity

卡介苗(mycobacterium bovis bacillus calmetteguérin，BCG)用于結(jié)核病的預(yù)防已有近一百年的歷史了，在全世界范圍內(nèi)已經(jīng)接種超過40億人口 ［1］。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)BCG對不同地區(qū)人群的免疫保護效果差異較大，其有效性為0%～80%不等，尤其是BCG對于成人結(jié)核病的預(yù)防作用極差，研制新型抗結(jié)核疫苗等成為目前的研究熱點，如蛋白質(zhì)亞單位疫苗、DNA疫苗和重組BCG疫苗等 ［2－3］，本文就抗結(jié)核重組BCG疫苗的研究進展作一綜述。

1　抗結(jié)核重組BCG疫苗研究的必要性

雖然BCG在全世界范圍內(nèi)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的預(yù)防接種，但并未十分有效地阻止結(jié)核病的蔓延，相反，近年來結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)上升趨勢，使人們不得不對BCG的預(yù)防作用進行重新評估。研究發(fā)現(xiàn)新生兒或嬰幼兒接種卡介苗后，可以有效預(yù)防兒童時期結(jié)核病的發(fā)生，但不能預(yù)防成年后結(jié)核病的發(fā)生 ［4－5］。在一項歷時15年的隨機雙盲對照研究中，超過10 000人被隨機分為BCG免疫接種組和安慰劑對照組，免疫接種后定期篩查結(jié)核桿菌感染者及結(jié)核病患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卡介苗接種對預(yù)防成人結(jié)核病幾乎無保護作用 ［6］。因此，急需研制可預(yù)防成人結(jié)核病的新型抗結(jié)核疫苗，近年來，國內(nèi)外學(xué)者對蛋白質(zhì)亞單位疫苗、DNA疫苗、重組痘苗病毒疫苗、重組恥垢分支桿菌疫苗等在結(jié)核病預(yù)防中的作用進行了大量研究，但就其安全性、有效性等方面的綜合數(shù)據(jù)分析來看，這些疫苗短時間內(nèi)仍難以取代BCG ［7－8］。因而，在研制新型抗結(jié)核疫方面，對BCG進行重組和改造以增強其免疫原性和免疫保護性，可能是更加切合實際和行之有效的研究途徑 ［9］。對于那些免疫功能缺陷的患者，如HIV患者，BCG的免疫接種可能導(dǎo)致播散性結(jié)核病的發(fā)生，也需對BCG進行進一步減毒和改造 ［10］。

2　抗結(jié)核重組BCG的研究策略及其研究進展

2.1　過量表達結(jié)核桿菌免疫優(yōu)勢抗原的重組BCG

研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核桿菌某些抗原分子不僅在其菌體蛋白或分泌性蛋白中含量較高，而且其免疫原性較強，在感染結(jié)核桿菌的患者體內(nèi)，針對這些抗原分子的抗體含量亦較高，因而被認為是結(jié)核桿菌的免疫優(yōu)勢抗原，如Ag85A、Ag85B、Ag85C和HspX蛋白等，構(gòu)建重組BCG過量表達其免疫優(yōu)勢抗原可能增強BCG的免疫活性。在這方面，目前研究得最多的是Ag85B，在感染結(jié)核桿菌的患者體內(nèi)抗Ag85B抗體檢出率較高 ［11］，Ag85B含有多個T淋巴細胞識別表位，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的Th1型細胞免疫應(yīng)答 ［12］。Horwitz等 ［13］構(gòu)建了過表達Ag85B的重組BCG(rBCG-85B)，將103CFU的rBCG-85B給豚鼠皮下單次注射進行免疫接種，免疫9周后用致病性結(jié)核桿菌進行攻擊實驗，隨后的檢測發(fā)現(xiàn)接受rBCG-85B免疫的豚鼠抵抗結(jié)核桿菌攻擊的免疫保護作用明顯強于接受親代BCG免疫的豚鼠。另一個研究得較多的免疫優(yōu)勢抗原是Ag85A，Ag85A抗原分子中也存在多個CD4 +和CD8 +T淋巴細胞的特異性識別表位 ［14－15］，Sugawara等 ［16］構(gòu)建了過表達Ag85A的重組BCG(rBCG-85A)，給恒河猴進行免疫接種，然后用致病性結(jié)核桿菌進行攻擊實驗，發(fā)現(xiàn)接受rBCG-85A免疫的動物其肺組織病理損害明顯輕于接受親代BCG免疫的動物。Jain等 ［17］則對過量表達結(jié)核桿菌Ag85C的重組BCG (rBCG-85C)進行了研究，豚鼠接種rBCG-85C或親代BCG第6周后，用結(jié)核桿菌H37Rv株進行攻擊實驗，攻擊10周后取動物的脾、肝和肺組織，觀察其病變程度，并對脾和肺組織勻漿進行結(jié)核桿菌培養(yǎng)，計數(shù)其菌落，發(fā)現(xiàn)接種rBCG-85C的豚鼠其脾、肝和肺組織的病變程度顯著輕于接種親代BCG的豚鼠，接種rBCG-85C的豚鼠其脾和肺組織勻漿培養(yǎng)后生長出的結(jié)核桿菌菌落數(shù)也顯著低于接種親代BCG的豚鼠。在隨后的研究中，Wang等 ［18］不僅構(gòu)建了可過表達單個抗原蛋白的重組BCG，即前述的rBCG-85A和rBCG-85B，還構(gòu)建了可同時過表達Ag85A和Ag85B的重組BCG(rBCG-AB)，將其免疫C57BL/6小鼠后檢測其免疫原性和免疫保護性，發(fā)現(xiàn)3株重組BCG的免疫原性和免疫保護性均強于親代BCG，而rBCGAB的免疫原性和免疫保護性明顯強于過表達單個免疫優(yōu)勢抗原的重組BCG。

2.2　表達RD區(qū)抗原的重組BCG

比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，BCG與致病性結(jié)核分枝桿菌在基因組水平存在明顯差異，目前共發(fā)現(xiàn)16個差異區(qū)域(region of difference，RD)，分別命名為RD1-RD16 ［19］。BCG傳代培養(yǎng)過程中由于遺傳變異等因素導(dǎo)致這些區(qū)域在BCG基因組缺失。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這些區(qū)域含有多個與結(jié)核桿菌致病性和免疫性相關(guān)的重要抗原基因，如RD1區(qū)可編碼ESAT-6、CFP-10及PPE68等結(jié)核桿菌免疫優(yōu)勢抗原。構(gòu)建可表達RD區(qū)抗原的重組BCG可能增強BCG的免疫活性。Bao等 ［20］構(gòu)建了可分泌表達ESAT-6抗原蛋白的重組BCG以及可將ESAT-6錨定于細胞膜表達的重組BCG，并以小鼠作為接種對象，對這兩株BCG的毒力、免疫原性和免疫保護性進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩株重組BCG的毒力與親代BCG相比較沒有明顯差別，免疫接種后8～12周內(nèi)兩株重組BCG比親代BCG可產(chǎn)生更高水平的抗體和更強的細胞免疫應(yīng)答，但其免疫保護效應(yīng)與親代BCG相比較沒有明顯差異。Deng等 ［21－22］構(gòu)建了可表達Ag85A的重組BCG(rBCG-85A)、可表達ESAT-6的重組BCG(rBCG-E6)以及可表達Ag85A-ESAT-6融合蛋白的重組BCG (rBCG-AE)，比較分析這三株重組BCG及親代BCG在動物體內(nèi)的免疫原性及免疫保護性，發(fā)現(xiàn)rBCG-AE免疫小鼠所產(chǎn)生的特異性抗體應(yīng)答和Th1型細胞免疫應(yīng)答均明顯強于rBCG-85A、rBCG-E6以及親代BCG，但rBCG-AE并不能增強小鼠抵抗致病性結(jié)核桿菌攻擊的能力，甚至其免疫保護作用還不及其親代BCG。Ma等 ［23］將兩個拷貝的esat-6基因插入ag85a基因的ACCⅠ酶切位點形成融合基因，將此融合基因分別克隆入含突變的furA啟動子的分支桿菌差異表達載體pMFA11和pMFA41，獲得rBCG186和rBCG486兩株重組BCG，Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)rBCG486融合蛋白Ag856A2的表達量比rBCG186高出3倍以上，這兩株重組BCG與親代BCG分別免疫C57BL/6小鼠，免疫8周后每組取6只小鼠處死后分離小鼠脾淋巴細胞，檢測其抗原特異性IFN-γ的誘導(dǎo)表達情況，其余免疫小鼠用致病性結(jié)核桿菌H37Rv進行攻擊實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rBCG486免疫小鼠脾淋巴細胞IFN-γ的誘導(dǎo)表達量明顯高于rBCG186和親代BCG免疫小鼠，rBCG486和rBCG186免疫小鼠抵抗致病性結(jié)核桿菌攻擊的能力均明顯強于親代BCG，但兩株重組BCG的免疫保護效應(yīng)無顯著差異。Sali等 ［24］將結(jié)核桿菌PE-PGRS33蛋白的PE功能區(qū)與結(jié)核桿菌RD2區(qū)抗原MPT64融合表達構(gòu)建重組BCG，由于PE-PGRS33蛋白是結(jié)核桿菌的一個膜蛋白，其PE功能區(qū)具有膜錨定功能，可引導(dǎo)MPT64蛋白定位于卡介苗膜表面表達，該重組BCG接種小鼠后檢測其免疫保護性，發(fā)現(xiàn)其免疫保護效應(yīng)明顯強于親代BCG，該研究還構(gòu)建了可在胞漿中表達MPT64蛋白的重組BCG，發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)特異性細胞免疫應(yīng)答的能力明顯弱于可將MPT64膜錨定表達的重組BCG，該研究同時還發(fā)現(xiàn)MPT64蛋白的表達量也能影響其免疫效果，必須使用含強啟動子(如分支桿菌hsp60啟動子)的表達載體讓MPT64蛋白在重組BCG過量表達才能產(chǎn)生更有效的免疫應(yīng)答。

2.3　表達某些細胞因子的重組BCG

某些細胞因子具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)能增強抗原遞呈細胞共刺激分子B7的表達及MHC II類抗原分子的表達，促進抗原遞呈細胞前體細胞的成熟，增強其抗原遞呈能力。白細胞介素12(IL-12)能促進Th1型淋巴細胞的分化增殖和功能的提高，誘導(dǎo)CTL和NK細胞的細胞毒活性。白細胞介素15(IL-15)能促進自然殺傷細胞、T細胞及某些內(nèi)皮細胞的發(fā)育，并且是記憶性T細胞的生長因子和調(diào)節(jié)因子，而且能誘導(dǎo)細胞毒性T細胞的活化和增殖。將這些細胞因子與結(jié)核桿菌免疫優(yōu)勢抗原共表達或融合表達構(gòu)建重組BCG，有可能增強BCG的免疫活性 ［25－26］。Ryan等 ［27］構(gòu)建了可分泌表達小鼠GMCSF的重組BCG(rBCG-GM-CSF)，其所表達的GMCSF能刺激小鼠骨髓源性前體細胞分化為成熟的抗原遞呈細胞，用這種rBCG-GM-CSF免疫小鼠7到14天后，其引流淋巴結(jié)具有CD11c +MHCⅡ +和CD11c -CD11b +F480 +表面標志的成熟抗原遞呈細胞數(shù)目及這些抗原遞呈細胞表達協(xié)同刺激分子的數(shù)目均顯著高于親代BCG免疫的小鼠，免疫攻擊實驗發(fā)現(xiàn)rBCG-GM-CSF免疫小鼠抵抗結(jié)核桿菌攻擊的能力顯著強于親代BCG免疫的小鼠。Yang等 ［28］將GM-CSF與ESAT-6融合表達構(gòu)建重組BCG(rBCG-GE)，同時構(gòu)建了可表達GM-CSF的重組BCG (rBCG-GM-CSF)和可表達ESAT-6的重組BCG(rBCG-E6)，將其分別免疫BALB/c小鼠后檢測其免疫原性，比較分析發(fā)現(xiàn)rBCG-GE能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更高水平的抗體和更強的Th1型細胞免疫應(yīng)答，但該研究未進一步檢測rBCG-GE的免疫保護效應(yīng)。Tang等 ［29］構(gòu)建了可表達結(jié)核桿菌Ag85B與IL-15融合蛋白的重組BCG(rBCG-85B-IL15)，動物免疫接種后發(fā)現(xiàn)，rBCG-85B-IL15誘導(dǎo)CD4 +和CD8 +記憶性T細胞增殖和產(chǎn)生γ-干擾素的能力明顯強于rBCG-85B，而且rBCG-85B-IL15誘導(dǎo)CD8 +記憶性T細胞的能力明顯強于其對CD4 +記憶性T細胞的誘導(dǎo)作用，因而可能產(chǎn)生更強和更持久的抗結(jié)核免疫保護作用。Deng等 ［30］將人白細胞介素IL-12的p70亞單位與結(jié)核桿菌Ag85A抗原融合表達構(gòu)建重組BCG(rBCG-IA)，免疫接種BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)接種后第2-8周rBCG-IA免疫組所產(chǎn)生的特異性抗體、脾淋巴細胞增殖率及產(chǎn)生IFN-γ的能力均明顯高于親代BCG。但rBCG-IA免疫小鼠抵抗結(jié)核桿菌攻擊的能力與親代BCG相比較無顯著差異。

2.4　營養(yǎng)缺陷型重組BCG

Grode等 ［31］采用電穿孔法將攜帶李斯特菌溶菌素基因的大腸桿菌分支桿菌穿梭表達載體pMV306hyg-Hly導(dǎo)入BCG尿素酶C缺陷株，構(gòu)建了攜帶李斯特菌溶解素而自身尿素酶C缺乏的重組BCG (rBCG ΔureC: : hly)，將rBCG ΔureC: : hly及親代BCG分別免疫小鼠后，用致病性結(jié)核桿菌進行攻擊實驗，發(fā)現(xiàn)rBCG ΔureC: : hly免疫小鼠抵抗結(jié)核桿菌攻擊的能力比親代BCG更強，其免疫保護作用也比親代BCG更持久。進一步研究發(fā)現(xiàn)rBCGΔureC: hly被抗原遞呈細胞攝取后，由于尿素酶C缺乏可以顯著降低所形成的吞噬溶酶體的pH值，使李斯特菌溶菌素充分顯示其膜穿孔活性，大量分支桿菌抗原肽及溶酶體水解酶漏出到宿主細胞胞漿中，促進抗原遞呈細胞凋亡，進而促進抗原的交叉遞呈(cross-priming)，使更多的分支桿菌抗原肽與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合而遞呈給CD8 +T細胞，從而誘導(dǎo)更強的抗結(jié)核細胞免疫應(yīng)答。Gengenbacher等 ［32］進一步敲除rBCG ΔureC: : hly的維生素B 6合成酶基因pdx1 (Rv2606c)構(gòu)建BCG營養(yǎng)缺陷株BCG ΔureC: : hlyΔ pdx1，在外源性添加維生素B6的情況下，BCG ΔureC: : hlyΔ pdx1免疫小鼠后短期內(nèi)可產(chǎn)生與親代BCG相似的免疫保護效應(yīng)，但長時間觀察發(fā)現(xiàn)其免疫保護作用不及BCG ΔureC: : hlyΔ pdx1及親代BCG，但重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠接種BCGΔureC: : hlyΔ pdx1后，其存活時間較接種rBCG ΔureC: : hly及親代BCG者明顯延長，因而這種營養(yǎng)缺陷型重組BCG可能更適合于免疫功能低下的患者(如HIV患者)的免疫接種。

3　問題與展望

綜上所述，由于BCG免疫保護效應(yīng)的不穩(wěn)定性，構(gòu)建重組BCG增強其免疫效應(yīng)成為近年來新型結(jié)核病疫苗研究的熱點之一。雖然研究發(fā)現(xiàn)某些重組BCG相對于親代BCG具有明顯的優(yōu)越性，但也還存在一些亟待解決的問題: (1)構(gòu)建重組BCG時使用質(zhì)粒載體可能導(dǎo)致機體對抗生素耐藥的問題; (2)引入細胞子可能干擾機體的正常免疫功能; (3)目前機體抗結(jié)核免疫應(yīng)答以及結(jié)核桿菌免疫逃逸的分子機制尚未完全闡明，因而，難以選擇最佳的抗原組合使重組BCG達到最佳的免疫效果。這些問題仍有待于進一步深入研究加以解決。隨著分子免疫學(xué)學(xué)科的不斷發(fā)展，研究方法和研究手段將越來越先進，相信在不久的將來，抗結(jié)核重組BCG疫苗研究一定會取得新的突破。