劉 玉，贊哈爾，何曉輝，朱小奇，申 紅，王俊剛

(石河子大學 a 動物科技學院，b 農(nóng)學院，新疆 石河子 832003)

白痢雞糞培養(yǎng)蠅蛆抗菌肽對白痢沙門菌感染雛雞的療效觀察

劉 玉a，贊哈爾a，何曉輝a，朱小奇a，申 紅a，王俊剛b

(石河子大學 a 動物科技學院，b 農(nóng)學院，新疆 石河子 832003)

【目的】 用白痢雞糞培養(yǎng)蠅蛆，探究蠅蛆抗菌肽對雞白痢沙門菌感染雛雞的治療效果。【方法】 用雞白痢沙門菌感染雛雞，收集雛雞糞便培養(yǎng)蠅蛆，粗提蠅蛆抗菌肽，測定其含量和抑菌活性，試驗同時設(shè)健康雞糞便培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽作為對照。分別用白痢雞糞和健康雞糞培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽治療白痢病雞，測定其腸道細菌數(shù)量和治愈率，試驗同時設(shè)抗生素組(恩諾沙星)和未治療對照組?！窘Y(jié)果】 白痢雞糞培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽含量顯著高于健康雞糞培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽(P<0.05)；2種雞糞培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽對大腸埃希菌、沙門菌和葡萄球菌均有抑制作用，但白痢雞糞培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽的抑菌活性顯著高于健康雞糞培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽(P<0.05)；蠅蛆抗菌肽治療白痢病雞后，白痢雞腸道細菌數(shù)量顯著低于對照組(未治療組)(P<0.05)，稍高于抗生素治療組(P>0.05)，但白痢雞腸道細菌數(shù)量均達到健康雞的標準范圍。白痢雞糞培養(yǎng)蠅蛆抗菌肽組的治愈率為43.33%，與健康雞糞培養(yǎng)蠅蛆抗菌肽組和抗生素組差異不明顯?！窘Y(jié)論】 白痢雞糞培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽對沙門菌感染的雞白痢病具有治療作用。

白痢雞糞；蠅蛆抗菌肽；抑菌活性；治愈率

雞白痢是由白痢沙門菌引起的以排白色糞便為常見特征的一種急性敗血性傳染病[1]，它給養(yǎng)殖者造成嚴重的直接或間接經(jīng)濟損失；同時，病死雞的尸體及糞便被丟棄或深埋地下，不僅對水質(zhì)、土壤造成嚴重污染，而且可能形成新的傳染源，對臨近的健康雞場構(gòu)成威脅，嚴重阻礙了集約化養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。為了控制細菌性疾病的發(fā)生與流行，人們大量使用抗生素，這不僅導致致病菌的耐藥性逐漸增加[2]，還造成畜禽產(chǎn)品中抗生素殘留超標，嚴重威脅著人類食品安全[3]。為應(yīng)對養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)需求，避免濫用抗生素，高效、廣譜、不易產(chǎn)生抗藥性、無殘留的綠色抗生素——抗菌肽迅速成為研究的熱點。

抗菌肽(Antimicrobial peptides)是生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類具有生物活性的抵抗外界病原體感染的小分子肽類物質(zhì)，不僅對細菌具有高效廣譜的抗性，而且對真菌、病毒、寄生蟲也有一定的殺傷作用[4]。家蠅幼蟲即蠅蛆生長在腐爛物質(zhì)、糞便和垃圾等含有大量細菌的惡劣環(huán)境中，體表帶有許多病原菌，但其自身卻不受病原菌的影響，究其原由是蠅蛆體內(nèi)具有豐富的抗菌肽，從而保障其在病原微生物大量存在的環(huán)境中能夠生存繁殖，故蠅蛆抗菌肽的開發(fā)與應(yīng)用是解決畜牧養(yǎng)殖業(yè)中出現(xiàn)的細菌耐藥性問題的有效途徑之一。目前，家蠅作為飼料添加劑已經(jīng)應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，對疾病的預防和治療取得了良好的效果。鄒鋒[5]研究表明，用糞便和針刺法培養(yǎng)的家蠅幼蟲均能高水平表達抗菌肽，且2種方法產(chǎn)生的蠅蛆抗菌肽含量及抑菌活性接近。徐大剛等[6]研究表明，豬糞經(jīng)家蠅生態(tài)處理，其重量、含菌量和糞臭素等均明顯降低，處理后的豬糞可開發(fā)為生物肥料，轉(zhuǎn)化的蠅蛆飼喂豬可以提高豬的免疫力，既減少了環(huán)境污染又能產(chǎn)生經(jīng)濟效益。屈軍梅等[7]研究表明，家蠅抗菌肽對雛雞大腸埃希菌病具有良好的治療效果，能夠有效降低雛雞的死亡率，且不影響其正常生長。因此，本研究擬采用養(yǎng)殖場白痢病雞糞便養(yǎng)殖蠅蛆，提取蠅蛆抗菌肽，替代抗生素治療白痢病雞，分析其治療效果，旨在減少養(yǎng)殖場廢棄物污染，為緩解抗生素的濫用提供新的思路和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試蠅蛆由石河子大學新疆綠洲植保資源與農(nóng)業(yè)病蟲害治理重點實驗室提供；供試病原菌大腸埃希菌、沙門菌和葡萄球菌由石河子大學動物科技學院微生物實驗室提供；試驗所用15日齡艾維茵肉仔雞購于石河子孵化場，雛雞混合飼料購于泰昆集團公司。

1.2 蠅蛆抗菌肽粗提液的制備

將雞白痢沙門菌于肉湯培養(yǎng)基中進行擴繁后，接種到血清瓊脂斜面，37 ℃培養(yǎng)24 h，用生理鹽水沖洗菌苔，制成混懸液，用細菌標準比濁管計數(shù)法測定細菌數(shù)量。正式試驗前確定致雛雞白痢的沙門菌最低劑量，將沙門菌菌液分別配制成6.0×107，6.5×107，7.0×107，7.5×107，8.0×107，9.5×107，10.0×107，10.5×107，11.0×107CFU/mL梯度的菌懸液，進行分組腹腔注射，根據(jù)白痢率(即一組動物中排白色稀便動物數(shù)與該組動物總數(shù)的百分比)達到70%以上，確定雞白痢沙門菌菌液10.0×107CFU/mL為雛雞白痢病致病劑量。

選取30只15日齡健康雞，分別腹腔注射10.0×107CFU/mL的沙門菌培養(yǎng)液1 mL/只，感染24 h后試驗雞均出現(xiàn)了雞白痢癥狀(精神萎頓、縮頭、翅下垂、拉白色漿糊狀稀糞、肛門常被糞便粘住、排糞時發(fā)出“吱、吱”叫聲)，收集其糞便，培養(yǎng)蠅蛆，同時收集健康雞的糞便培養(yǎng)蠅蛆，分別稱取健康雞糞和白痢雞糞培養(yǎng)的活蠅蛆各1 g，用自來水反復沖洗8～10次，再用純凈水沖洗3次，濾紙吸干蛆體表面水分[8]。將蛆體放入高速組織搗碎機中，按蛆體m(mg)∶v(mL) =1∶3加入提取液(0.05 mol/L pH=5.0 乙酸銨緩沖液，0.35 μg/mL 苯甲基磺酰氟PMSF，2%巰基乙醇)充分搗碎，12 000 r/min高速冷凍離心30 min，取上清液，重復3次，合并上清液并于沸水浴中振蕩加熱5 min，迅速冷卻后，4 800 r/min離心30 min，取上清液(抗菌肽粗提液)置于-20 ℃冰箱，保存?zhèn)溆肹9]。

1.3 蠅蛆抗菌肽粗提液中抗菌肽含量及其抑菌活性的測定

1.3.1 抗菌肽含量測定 采用考馬斯亮藍法(Bradford法)測定蠅蛆抗菌肽粗提液中抗菌肽的含量。用分光光度計測定不同質(zhì)量濃度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL)標準蛋白(結(jié)晶牛血清白蛋白購于美國 Sigma 公司)OD595值，以標準蛋白質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光值OD595為縱坐標，繪制標準曲線，測定各組抗菌肽粗提液OD595值，結(jié)合標準曲線求得蠅蛆抗菌肽含量。

1.3.2 抑菌活性測定 將大腸埃希菌、沙門菌和葡萄球菌分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)，24 h后用蒸餾水10倍稀釋各菌液，吸取0.2 mL于普通瓊脂培養(yǎng)基，涂抹均勻，制成含病原菌培養(yǎng)皿。采用藥敏紙片法(根據(jù)美國臨床標準委員會(2004)NCCLS標準推薦)測定蠅蛆抗菌肽的抑菌活性。分別將含各試驗組蠅蛆抗菌肽提取液的紙片置于上述含病原菌培養(yǎng)皿中，于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。試驗同時設(shè)無菌水對照組。

1.4 蠅蛆抗菌肽對白痢的治療效果

選取120只試驗雞，建立雞白痢模型。將已致病的白痢病雞分為抗生素組(恩諾沙星，劑量按照說明書，50 mg/L，2 mL/只)、白痢病雞糞培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽組(2 mg/mL，2 mL/只)、健康雞糞培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽組(2 mg/mL，2 mL/只)和對照組(無菌水2 mL/只)，各試驗組于治療前停止飲水2 h，然后將蠅蛆抗菌肽粗提液、恩諾沙星和無菌水按2 mL/只混入飲水器中，所用水量滿足雞一次飲完，每天用藥2次(10:00和18:00)，連續(xù)治療5 d。

1.4.1 雞腸道細菌數(shù)量測定 分別收集健康雞糞便和白痢病雞治療前(0 d)與治療后1，3和5 d的糞便2 g，將糞便倍比稀釋，經(jīng)過7次10倍稀釋達到0.2×10-7g/mL時，取100 μL接種到普通瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計細菌菌落數(shù)，測定健康雞和白痢病雞治療前后腸道細菌數(shù)量。

1.4.2 治愈率的測定 試驗結(jié)束時統(tǒng)計治愈白痢病雞數(shù)量，計算治愈率。治愈判定標準為雞白痢典型癥狀(精神沉郁或昏睡，排白色黏稠或淡黃、淡綠色稀便，肛門有時被硬結(jié)的糞塊封閉，呼吸困難等)消失，白痢病雞腸道細菌含量達到健康雞腸道的標準。

1.5 飼養(yǎng)管理

試驗期間按時定量給料，經(jīng)常換水，保證飼料充足，水質(zhì)新鮮，注意通風，保持雞舍內(nèi)的環(huán)境衛(wèi)生。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示，利用統(tǒng)計分析SPSS 17.0軟件進行顯著性檢驗，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 白痢病雞糞培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽含量

標準蛋白曲線如圖1所示，曲線擬合的方程為：y=0.927 1x+0.052 1。各試驗組糞便培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽含量測定結(jié)果顯示，用健康雞糞便培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽粗提液(OD595為0.55)中抗菌肽含量((0.54±0.01) mg/mL)顯著低于白痢雞糞便培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽粗提液(OD595為0.76，抗菌肽含量為(0.76±0.06) mg/mL)(P<0.05)，說明白痢雞糞便中致病細菌可以有效地刺激蠅蛆產(chǎn)生高表達量的抗菌肽。

2.2 白痢病雞糞培養(yǎng)蠅蛆抗菌肽的抑菌活性

由表1可以看出，健康雞糞和白痢雞糞培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽對大腸埃希菌、沙門菌和葡萄球菌均有抑制作用，白痢雞糞培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽對3種病原菌的抑菌圈直徑差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于健康雞糞培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽的抑菌圈直徑(P<0.05)，其中對葡萄球菌的抑制活力最強，沙門菌次之。

2.3 蠅蛆抗菌肽對白痢雞腸道細菌數(shù)量的影響

表2結(jié)果顯示，抗生素和蠅蛆抗菌肽治療組白痢病雞腸道細菌數(shù)量均呈現(xiàn)下降趨勢，治療第5天時，白痢病雞腸道細菌數(shù)量基本下降至健康雞腸道細菌數(shù)量((3.26±0.85)×105CFU/g)水平；白痢雞糞培養(yǎng)蠅蛆抗菌肽組治療1，3，5 d時雞腸道細菌數(shù)量均高于抗生素治療組(P>0.05)，于第3天時顯著低于健康雞糞培養(yǎng)蠅蛆抗菌肽治療組(P<0.05)，這可能是由于白痢雞糞便中沙門菌刺激蠅蛆產(chǎn)生的抗菌肽對沙門菌引起雞白痢病的抵抗力高于其他細菌引起的疾病，與表1的測定結(jié)果一致(健康雞糞便培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽對沙門菌的抵抗力低于白痢雞糞便培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽)。對照組的白痢病雞由于自身免疫作用，細菌數(shù)量也呈現(xiàn)下降趨勢，但仍處于細菌感染的白痢狀態(tài)。

注：“-”表示無抑菌圈的產(chǎn)生。同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note:“-” means no inhibition zone.Different uppercase and lowercase letters indicate highly significant(P<0.01)and significant differences(P<0.05),respectively.The same below.

表2 白痢雞糞培養(yǎng)蠅蛆抗菌肽治療后白痢雞腸道細菌數(shù)量的變化
Table 2 Change of bacteria number in pullorum chicken cured by AMPs cultured with pullorum chicken feces CFU/g

2.4 蠅蛆抗菌肽對白痢病雞的治療效果

由表3可知，對照組的治愈率(16.67%)極顯著低于其他治療組(P<0.01)。白痢雞糞培養(yǎng)蠅蛆抗菌肽組治愈率(43.33%)與健康雞糞培養(yǎng)蠅蛆抗菌肽組的治愈率(36.67%)差異不顯著，抗生素組的治愈率(63.33%)極顯著高于健康雞糞培養(yǎng)蠅蛆抗菌肽組(P<0.01)，但與白痢雞糞培養(yǎng)蠅蛆抗菌肽組差異不顯著。

3 討 論

抗菌肽廣泛存在于生物界，是輔助生物機體抵抗外來病原體入侵的重要防御分子，不僅能抑制、殺滅多種細菌，而且具有抗真菌、寄生蟲、病毒等作用，且不產(chǎn)生耐藥性[10]。日糧中添加外源性抗菌肽能抑制病原菌，對腸道正常菌群和機體細胞無殺傷作用[11]。蠅蛆被細菌感染或通過針刺、超聲波、紫外線等物理方式刺激，能夠提高抗菌肽的表達水平[12]。本試驗結(jié)果顯示，白痢雞糞便培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽含量顯著高于健康雞糞培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽含量(P<0.05)，說明白痢雞糞便中致病細菌可能有效刺激蠅蛆產(chǎn)生了高表達量的抗菌肽。蠅蛆抗菌肽抑菌活性的測定結(jié)果顯示，健康雞和白痢雞糞便培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽對大腸埃希菌、沙門菌以及葡萄球菌均有抑制作用，說明蠅蛆能產(chǎn)生針對不同外源微生物的免疫反應(yīng)，其抗菌肽表達針對不同刺激原可能產(chǎn)生不同的抗菌性能。

雛雞腸道內(nèi)正常菌群尚未完全建立，對外界病原微生物的抵抗能力較差。何昭陽等[13]研究表明，0日齡雛雞消化道無細菌，出殼1 h后，十二指腸、盲腸中發(fā)現(xiàn)少量腸球菌和真桿菌，1 日齡發(fā)現(xiàn)少量大腸埃希菌，5～6日齡后可以監(jiān)測到各類細菌大量繁殖，18日齡后菌群結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。本試驗對15日齡的肉仔雞腹腔注射感染沙門菌，通過消化道進入腸道，在腸道內(nèi)繁殖，影響腸道正常菌群生長，使其產(chǎn)生毒素，引起腹瀉或白痢，排出大量致病菌，因此可用糞便中細菌總數(shù)估測腸道內(nèi)致病菌數(shù)量。口服蠅蛆抗菌肽對白痢病雞腸道細菌數(shù)量影響的測定結(jié)果顯示，對照組(未治療)白痢雞腸道細菌數(shù)量略有下降但相對穩(wěn)定，表明未治療組雞腸道內(nèi)致病細菌數(shù)量維持在一個較高的病理狀態(tài)；健康雞糞便培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽、白痢雞糞培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽與抗生素治療白痢病雞后，雞腸道細菌數(shù)量下降較為明顯，表明雛雞腸道內(nèi)致病菌數(shù)量逐漸減少，白痢癥狀開始改善，這與白痢雞治愈率的統(tǒng)計結(jié)果一致，說明蠅蛆抗菌肽對雞白痢病有一定的療效。白痢雞糞便培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽對白痢雞的治療效果高于健康雞糞便培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽，但低于抗生素，這是否與蠅蛆抗菌肽的使用劑量有關(guān)，尚待進一步研究。

綜上所述，白痢雞糞便培養(yǎng)的蠅蛆抗菌肽與抗生素一樣也可以治療雞白痢病，使用蠅蛆抗菌肽治療雞白痢病不會破壞雞腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，長期應(yīng)用也不會造成抗藥性和藥物殘留等問題，對雞的抗病保健還能起到良好的作用，可以考慮作為飼料添加劑運用于養(yǎng)禽業(yè)。

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Curing effects of maggot antimicrobial peptides cultured with pullorum chicken feces againstSalmonellapulloruminfected chicken

LIU Yua,ZAN Ha-era,HE Xiao-huia,ZHU Xiao-qia,SHEN Honga,WANG Jun-gangb

(aCollegeofAnimalScienceandTechnology,bCollegeofAgriculture,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832003,China)

【Objective】 Maggot antimicrobial peptides (AMPs) cultured with pullorum chicken feces were used to cureSalmonellapulloruminfected chicken.【Method】 In this research,maggot cultured by pullorum disease of chicken feces were collected,and concentration and antibacterial activity of AMPs were measured after AMPs were extracted crudely.Maggot cultured with uninfected healthy chickens was used as control.Then,maggot AMPs were used to cureSalmonellapulloruminfected chicken,and the number of intestinal bacteria and cure rate were measured.One antibiotic group and one untreated group were also set up.【Result】 The concentration and antibacterial activity of maggot AMPs cultured with pullorum chicken were significantly higher than those of the healthy group (P<0.05).AMPS from both groups had inhibition ability againstE.coli,SalmonellaandStaphylococcusaureus.The number of intestinal bacterial in infected chicken was significantly lower than that in the control group (untreated group) (P<0.05),but higher than that in the antibiotic treatment group (P<0.05).It met the standard of intestinal number for healthy chicken.The cure rate of maggot AMPs cultured by pullorum chicken was 43.33%,the difference is not obvious with the chicken manure and health training bots antibacterial peptide group.【Conclusion】 Maggot AMPs cultured with pullorum chicken feces had curing effects againstSalmonellapulloruminfected chicken.

white diarrhea chicken;maggot antimicrobial peptides;antibacterial activity;cure rate

2014-06-05

國家自然科學基金項目(31060281)；兵團科技成果轉(zhuǎn)化及產(chǎn)業(yè)化引導計劃項目(2012BD056)

劉 玉(1987-),男，新疆石河子人，碩士，主要從事動物生理學與生物化學研究。E-mail：gundam19871104@sina.com

申 紅(1970-)，女(蒙古族)，新疆石河子人，副教授，碩士生導師，主要從事動物生理生化研究。 E-mail：shenhong98@163.com

時間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.027

S858.315

A

1671-9387(2015)07-0024-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.027.html