龔 勝,孫海燕,張 珂,曾 媛,李 婧,王 健,李新國(guó)

(海南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228)

三色堇花色素合成途徑中部分結(jié)構(gòu)基因的克隆及生物信息學(xué)分析

龔 勝,孫海燕,張 珂,曾 媛,李 婧,王 健,李新國(guó)

(海南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228)

【目的】 對(duì)三色堇花色素合成的3個(gè)結(jié)構(gòu)基因VwCHS、VwCHI和VwF3H進(jìn)行克隆以及生物信息學(xué)分析。【方法】 利用RACE/PCR技術(shù)克隆得到VwCHS、VwCHI和VwF3H基因的全長(zhǎng)序列，并通過(guò)在線分析軟件對(duì)其生物信息學(xué)進(jìn)行分析。【結(jié)果】 獲得VwCHS、VwCHI和VwF3H的cDNA全長(zhǎng)分別是1 481，975和1 361 bp；經(jīng)多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因編碼的氨基酸與其他植物相關(guān)氨基酸一致性較高，主要集中在62%～90%，并且在CHS氨基酸序列中有4個(gè)催化活性位點(diǎn)(Cys171、Phe222、His310、Asn343)，在CHI氨基酸序列中有4個(gè)催化活性位點(diǎn)(Thr50、Tyr108、Asn115、Ser192)，在VwF3H氨基酸序列中有5個(gè)催化活性位點(diǎn)(Asp218、His253、Arg215、Arg284、Ser286)；VwCHS、VwCHI、VwF3H的蛋白質(zhì)分子量分別為9.91，5.37，4.1 ku，等電點(diǎn)為5.02，5.16，5.44；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，VwCHS和VwCHI二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是α螺旋，分別占43.39%和41.89%，VwF3H的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是無(wú)規(guī)則卷曲，占42.30%；聚類分析發(fā)現(xiàn)VwCHS、VwCHI和VwF3H分別歸屬于各自的聚類簇。【結(jié)論】 VwCHS、VwCHI和VwF3H是不存在信號(hào)肽的非跨膜蛋白。

三色堇；查爾酮合成酶(CHS)；查爾酮異構(gòu)酶(CHI)；黃烷酮-3-羥化酶(F3H)；生物信息學(xué)；基因克隆

花色是植物最具有吸引力的觀賞性狀之一，它賦予了植物無(wú)窮的魅力?；ㄉ厥鞘怪参锍尸F(xiàn)萬(wàn)千色彩的內(nèi)在原因之一，其分布于植物的細(xì)胞液泡中，能使花呈現(xiàn)出橙色、紅色、紫色或藍(lán)色等?；ㄉ氐男纬膳c分布主要受兩大類型基因的控制：一類是與花色素形成相關(guān)的催化酶基因，即結(jié)構(gòu)基因[1]；另一類是調(diào)控催化酶基因表達(dá)的調(diào)控基因[2-4]。與花色素形成相關(guān)的催化酶基因是花色素生物合成的基礎(chǔ)，20世紀(jì)80年代末至90年代初，植物花色素和類黃酮物質(zhì)代謝途徑已研究的較為清楚[5]?；ㄉ氐纳锖铣赏緩酱笾掳?個(gè)階段：第1階段是苯丙氨酸以苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸羥化酶(C4H)和CoA連接酶(4CL)為催化劑反應(yīng)生成4-香豆酰CoA，該過(guò)程主要受PAL基因調(diào)控；第2階段是4-香豆酰CoA在查爾酮合成酶(chalcone synthase,CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase,CHI)、黃烷酮-3-羥化酶(flavanone-3-hydroxylase,F3H)的催化作用下形成二氫黃酮醇；第3階段是花色素的形成，該過(guò)程依次需要類黃酮-3′-羥化酶(flavonoid-3′-hydroxylase，F(xiàn)3′H)、類黃酮-3′,5′-羥化酶(flavonoid-3′,5′-hydroxylase，F(xiàn)3′5′H)、二羥基黃酮醇4-還原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)、花青素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)等為催化劑[6-7]。在花青素生物合成途徑中，第2階段的催化酶CHS、CHI和F3H為形成有色化合物所必需。

植物的花斑是花色素在某個(gè)特定區(qū)域的積累，它直接影響植物的觀賞價(jià)值，而了解花斑形成機(jī)理對(duì)于觀賞植物的花色育種有著十分重要的意義。以色斑區(qū)域色素合成催化酶基因的特異性表達(dá)作為研究花斑機(jī)理的著手點(diǎn)無(wú)疑為花斑機(jī)理研究提供了一個(gè)新的方向。三色堇(Viola×wittrockiana)是堇菜科堇菜屬的一二年生花卉，其花色艷麗，花期長(zhǎng)，為冬季花壇、花境及盆花等常用花卉，近年來(lái)在我國(guó)得到了大量園林應(yīng)用。三色堇花瓣色斑區(qū)域較大，色斑區(qū)與非色斑區(qū)界線比較明顯，它的花斑遺傳規(guī)律和花色組成研究基礎(chǔ)較好，是研究花斑機(jī)理的理想模式植物[8]。目前關(guān)于花色素生物合成途徑中催化酶基因CHS、CHI和F3H的研究很多，如將反義CHS基因轉(zhuǎn)入矮牽牛中，從而抑制其花色素的合成，進(jìn)而獲得白花植株[9]；利用RNAi技術(shù)抑制煙草(Nicotianatabacum)內(nèi)源基因CHI轉(zhuǎn)錄，使其花瓣顏色發(fā)生了改變[10]；以反義抑制法抑制F3H基因表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株花色發(fā)生了不同程度的改變[11]。但是在三色堇中關(guān)于CHS、CHI和F3H基因的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。

生物信息學(xué)是包含了生物信息的獲取、處理、儲(chǔ)存、分析和解釋等在內(nèi)所有方面的一門交叉學(xué)科，它以核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)為研究對(duì)象，利用計(jì)算機(jī)、數(shù)學(xué)等手段對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、儲(chǔ)存、分析和解釋，目的在于了解和闡明大量生物學(xué)數(shù)據(jù)所包含的生物學(xué)意義[12]。生物信息學(xué)的誕生為更快捷地對(duì)已知的核酸和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)、分析、建立計(jì)算模型以及對(duì)蛋白質(zhì)組結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行預(yù)測(cè)奠定了基礎(chǔ)[13]。

本研究利用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增保守區(qū)域后使用RACE技術(shù)擴(kuò)增3′末端及5′末端，進(jìn)而獲得三色堇花色素合成相關(guān)的3個(gè)結(jié)構(gòu)基因的全長(zhǎng)序列，即VwCHS、VwCHI和VwF3H，再結(jié)合生物信息學(xué)的方法對(duì)這3個(gè)結(jié)構(gòu)基因的核酸序列和編碼氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的分析、預(yù)測(cè)，以期為三色堇花斑形成機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料為花色黃底黑斑三色堇(Viola×wittrockiana)‘賓哥’系列，種植于海南大學(xué)園藝園林學(xué)院基地。將花瓣采摘后迅速置入液氮中速凍，然后置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

三色堇花瓣總RNA的提取采用改良Trizol法[14]。提取完成后的總RNA用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.1 結(jié)構(gòu)基因VwCHS、VwCHI、VwF3H的擴(kuò)增 根據(jù)其他植物相關(guān)氨基酸序列獲得保守區(qū)域后，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(表1)。以三色堇總RNA為模板，參照TransScriptTMⅡ One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (TransGen，Beijing)說(shuō)明書進(jìn)行cDNA第一鏈合成，并以cDNA第一鏈為反應(yīng)模板擴(kuò)增3個(gè)結(jié)構(gòu)基因的保守區(qū)域。PCR反應(yīng)體系為：3 μL 第一鏈 cDNA,4 μL each primer (10 μmol/L),5 μL 10×PCR buffer, 4 μL 25 mmol/L MgCl2,4 μL 2.5 mmol/L dNTP Mixture,0.8 μL ExTaq(5 U/μL,Takara,China)和25.2 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s, 52～57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

利用保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE擴(kuò)增的特異性引物(表2)。以三色堇總RNA為模板，參照SMARTTMrace cDNA amplification kit (Clontech,Shanghai)說(shuō)明書進(jìn)行3′RACE和5′RACE擴(kuò)增。獲得全長(zhǎng)序列后，以其開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增特異性引物(表3)，進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增。

1.2.2 擴(kuò)增片段的克隆及生物信息學(xué)分析 利用1.6%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，并用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(中科瑞泰)回收特異性條帶，再連接pMD18-T Simple vector (Takara,Shanghai),轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落搖菌培養(yǎng)，最后利用M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測(cè)連接狀況。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將結(jié)果為陽(yáng)性的菌液送往上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

獲得序列后，利用NCBI的BLAST軟件分析比對(duì)序列，驗(yàn)證所得序列是否為目的基因序列；利用OFR Finder在線分析軟件分析開(kāi)放閱讀框；利用DNAMAN 6.0或ClustalW 2軟件將其與其他物種同源序列進(jìn)行多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析；使用Expasy和TMHMM Server v.2.0相關(guān)在線分析軟件，對(duì)編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和基本性質(zhì)進(jìn)行綜合預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三色堇花瓣總RNA的提取

經(jīng)改良Trizol法提取的三色堇花瓣總RNA利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，結(jié)果如圖1所示，RNA條帶清晰，28S與18S條帶亮度接近2∶1，說(shuō)明總RNA完整性好，點(diǎn)樣孔無(wú)殘留，表明純度高，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 三色堇花瓣總RNA電泳結(jié)果
M.DL2000 Marker;1～2.總RNA
Fig.1 Electrophoresis for total RNA of petals in pansy
M.DL2000 Marker;1-2.Total RNA

2.2 三色堇花色素合成中3個(gè)結(jié)構(gòu)基因的擴(kuò)增與克隆

首先，通過(guò)RT-PCR技術(shù)，從三色堇花瓣中擴(kuò)增得到3個(gè)結(jié)構(gòu)基因的部分片段，經(jīng)BLAST比對(duì)后,分別獲得CHS(432 bp)、CHI(438 bp)和F3H(461 bp)基因的保守區(qū)域(圖2)。其次，利用RACE技術(shù)，從三色堇花瓣中擴(kuò)增得到CHS(544 bp)、CHI(470 bp)和F3H(521 bp)基因的3′末端序列(圖3)，以及CHS(656 bp)、CHI(227 bp)和F3H(474 bp)基因的5′末端序列(圖4)。最后，將擴(kuò)增得到的3個(gè)結(jié)構(gòu)基因的中間片段、3′末端cDNA序列及5′末端cDNA序列利用DNAMAN 6.0軟件拼接后，分別獲得CHS、CHI、F3H基因的cDNA全長(zhǎng)序列，用全長(zhǎng)引物進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增得到CHS(1 481 bp)、CHI(975 bp)、F3H(1 361 bp)(圖5)。

圖4CHS、CHI、F3H基因5′RACE電泳結(jié)果
M.DL2000 Marker;1.CHS;2.CHI;3.F3H
Fig.4 Electrophoretogram for 5′RACE ofCHS,CHIandF3H

圖5CHS、CHI、F3H基因全長(zhǎng)擴(kuò)增電泳結(jié)果
M.DL2000 Marker;1.CHS;2.CHI;3.F3H
Fig.5 Electrophoretogram for full-length cDNA ofCHS，CHIandF3H

2.3 三色堇花色素合成中3個(gè)結(jié)構(gòu)基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)分離獲得3個(gè)三色堇花色素合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因，即VwCHS(GenBank登錄號(hào)為KJ463620)、VwCHI(GenBank登錄號(hào)為KJ463619)、VwF3H(GenBank登錄號(hào)為KJ463622)。

2.3.1VwCHS、VwCHI和VwF3H基因的核苷酸序列分析 利用BLAST在線分析軟件，將三色堇VwCHS、VwCHI和VwF3H基因的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因與其他植物相關(guān)基因的核苷酸序列相似性均超過(guò)69%。而ORF Finder在線分析軟件分析得到VwCHS、VwCHI和VwF3H基因的開(kāi)放閱讀框的長(zhǎng)度依次是1 212 bp(77-1 288)、651 bp(45-695)和1 098bp(35-1 132)，并分別編碼403，216和365個(gè)氨基酸。

2.3.2 VwCHS、VwCHI和VwF3H蛋白質(zhì)分析 (1)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析。將VwCHS、VwCHI和VwF3H編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因編碼的氨基酸與其他植物相關(guān)氨基酸的一致性較高，主要集中在62%～90%(表4)。

三色堇CHS基因編碼的氨基酸序列具有CHS發(fā)揮作用所必需的高度保守的催化活性位點(diǎn)Cys171、Phe222、His310和Asn343，其中Cys是香豆酰輔酶A的結(jié)合位點(diǎn)，并且還具有CHS特別保守的信號(hào)序列GFGPG，此外，在三色堇CHS基因編碼的氨基酸序列的163-179氨基酸(RLMMYQQGCFAGGTVLR)為查爾酮合成酶的活性位點(diǎn)(圖6)。在三色堇CHI基因編碼的氨基酸序列中，Thr50、Tyr108、Asn115和Ser192為CHI必需的活性位點(diǎn)，而其中Thr能催化黃酮醇底物中的酮基極性化(圖7-A)。在F3H氨基酸序列中，氨基酸殘基Asp218和His253是與鐵離子結(jié)合位點(diǎn)，而Arg215、Arg284和Ser286位點(diǎn)與2-酮戊二酸結(jié)合(RXS基序)，這些位點(diǎn)在不同物種的F3H氨基酸序列中都高度保守[15-17](圖7-B)。

利用Expasy在線分析軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VwCHS、VwCHI、VwF3H的蛋白分子量分別為9.91,5.37,4.1 ku，等電點(diǎn)分別為5.02，5.16，5.44。

通過(guò)TMHMM Server v.2.0在線分析軟件，對(duì)VwCHS、VwCHI和VwF3H的蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明三色堇中這3個(gè)蛋白質(zhì)整條肽鏈都位于細(xì)胞膜外，說(shuō)明它們都不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

利用signalp 4.1 server 軟件分析VwCHS、VwCHI和VwF3H的蛋白質(zhì)序列，發(fā)現(xiàn)它們的mean-s 分值分別為0.111，0.103和0.147，均小于0.5，說(shuō)明不存在信號(hào)肽序列。

(2)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。通過(guò)SOPMA在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得了三色堇CHS、CHI和F3H蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈以及無(wú)規(guī)則卷曲的組成(表5)。

2.3.3VwCHS、VwCHI和VwF3H基因編碼氨基酸序列的聚類分析 經(jīng)過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)，三色堇花瓣中的VwCHS、VwCHI和VwF3H蛋白都分別歸屬于各自的聚類簇，并且VwCHS與康乃馨(Dianthuscaryophyllus)的DcCHS蛋白質(zhì)親緣關(guān)系較近，VwCHI與毛果楊(Populustrichocarpa)的PtCHI蛋白質(zhì)親緣關(guān)系較近,VwF3H與陸地棉(Gossypiumhirsutum)的GhF3H蛋白質(zhì)親緣關(guān)系較近(圖8)。

3 結(jié)論與討論

CHS是Ⅲ型聚酮合成酶中的一種，是植物類黃酮生物合成途徑中第一個(gè)關(guān)鍵酶，其在調(diào)控類黃酮的生物合成以及類黃酮的成分方面具有決定性作用[18]。在植物中，查爾酮合成酶基因是多基因家族，并且在基因結(jié)構(gòu)上非常保守[19]。在三色堇CHS氨基酸序列與其他植物相關(guān)氨基酸的多重序列比對(duì)中可以看出，它們的一致性在65%～90%，而且構(gòu)成三色堇查爾酮合成酶蛋白催化中心的信號(hào)序列(G378FGPG)也是保守的[20]。這些都在一定程度上體現(xiàn)了查爾酮合成酶結(jié)構(gòu)上的保守性。查爾酮合成酶基因是類黃酮生物合成途徑中下游基因表達(dá)的限速因子，它對(duì)于花色的形成有著重要的影響，而且查爾酮合成酶基因的表達(dá)具有很強(qiáng)的時(shí)空特異性[21]。因此，為了制定三色堇花色育種策略，就需要對(duì)三色堇查爾酮合成酶基因的表達(dá)特異性和分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，以期為三色堇的花色育種提供一定的理論依據(jù)。

CHI是植物類黃酮生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，也是第一個(gè)被認(rèn)識(shí)的黃酮類化合物合成相關(guān)酶。CHI基因一般分為兩類，即CHIⅠ和CHIⅡ基因，其中CHIⅠ基因編碼的蛋白一般為210～240個(gè)氨基酸，蛋白間的同源性為50%～80%，CHIⅡ基因的典型結(jié)構(gòu)一般是由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成[16]。本研究從三色堇中克隆得到的CHI基因編碼的蛋白有216個(gè)氨基酸，且其與其他相關(guān)蛋白的同源性為62%～77%，因此推斷從三色堇中克隆得到的CHI基因可能屬于CHIⅠ型基因。對(duì)苜蓿CHI的三維結(jié)構(gòu)及突變分析表明，在CHI催化反應(yīng)中，Thr48、Tyr106、Asn113和Thr190等4個(gè)氨基酸殘基共同構(gòu)成了CHI的活性中心，其中Thr48、Tyr106和Asn113在大多數(shù)物種中都是保守的，但是Thr190只有在豆科植物中是保守的，在非豆科植物中第190位是絲氨酸(Ser)，但是底物沒(méi)有變化[22]。而從三色堇中得到的CHI蛋白，其中Thr50、Tyr108、Asn115和Ser192為CHI必需的活性位點(diǎn)，與苜蓿CHI蛋白活性位點(diǎn)相比，三色堇的CHI蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)后移了2個(gè)氨基酸位點(diǎn)。由于CHI基因是花色素生物合成途徑第2階段的關(guān)鍵酶之一，因此它在植物中表達(dá)量的多少直接影響花色素在植物中的積累。但是目前都是通過(guò)間接的手段來(lái)驗(yàn)證CHI基因的變化對(duì)花色的影響，如通過(guò)熒光定量PCR對(duì)銀杏葉片進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，查爾酮合成酶活性以及CHI基因的轉(zhuǎn)錄水平與葉片中黃酮類物質(zhì)的積累相關(guān)[23]；洋蔥查爾酮合成酶的失活使其花色變?yōu)榻鹕萚24]，而通過(guò)直接改變CHI基因來(lái)改變花色的研究還較少。因此，為了更好地了解三色堇花色形成機(jī)理，在今后的研究中可通過(guò)直接改變CHI基因來(lái)探究它的表達(dá)調(diào)控模式，這不僅可以豐富花色形成機(jī)理，還可以為三色堇花色育種提供理論體系支持。

F3H是植物黃酮類化合物代謝途徑上的關(guān)鍵酶，屬于依賴型2-酮戊二酸的雙加氧酶家族，其反應(yīng)需要2-酮戊二酸、分子氧、鐵和抗壞血酸作為輔助因子[25]。本研究結(jié)果表明,VwF3H蛋白有2個(gè)鐵離子結(jié)合位點(diǎn)(Asp218、His253)和3個(gè)2-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)(Arg215、Arg284、Ser286)。而分析苦蕎FtF3H蛋白三維結(jié)構(gòu)得出3個(gè)鐵離子結(jié)合位點(diǎn)(His221、Asp223、His279)和2個(gè)2-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)(Arg289、Ser291)，這些位點(diǎn)主要參與和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的代謝、翻譯后的修飾和加工，對(duì)蛋白質(zhì)活性非常重要[16]。F3H基因是花色素合成途徑第2階段的第3個(gè)關(guān)鍵酶，它的表達(dá)情況直接影響花色素在植物中的積累。目前關(guān)于三色堇中F3H基因的具體表達(dá)調(diào)控模式以及酶的底物選擇性還有待進(jìn)一步研究，這些不僅可以健全三色堇花色形成相關(guān)體系，還能夠?yàn)槠渌参锏幕ò哐芯刻峁┮罁?jù)。

在花青素的生物合成途徑中，CHS、CHI和F3H屬于第2階段反應(yīng)的關(guān)鍵酶，CHS、CHI和F3H3個(gè)基因的表達(dá)與否直接影響花青素的生物合成。近年來(lái)，關(guān)于CHS、CHI和F3H基因的研究主要集中于草本植物的花色代謝調(diào)控方面，如利用 RNA干擾技術(shù)，使夏堇(Toreniahybrida)中的CHS基因沉默，干擾了花色苷合成，從而將藍(lán)色花變?yōu)榘咨突野咨╗26]；矮牽牛中CHI基因突變后使得查爾酮積累，從而使花粉呈黃色或綠色[27]；通過(guò)RNA干擾技術(shù)處理藍(lán)紫色夏堇F3H基因，獲得白色花[28]。當(dāng)然人為調(diào)控花色代謝的手段還包括：導(dǎo)入外源基因或增加調(diào)節(jié)基因、改變環(huán)境因素等，這些也可以達(dá)到調(diào)控花色的目的，但是如果需要定向調(diào)控花色還是困難重重。本研究通過(guò)對(duì)三色堇花青素生物合成途徑中CHS、CHI和F3H基因的克隆與生物信息學(xué)分析，不僅獲得了它們的全長(zhǎng)序列，還對(duì)這些基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究，在豐富基因信息的同時(shí)還為健全花青素合成體系提供了一定理論支持。當(dāng)然，植物次生代謝調(diào)控是極其復(fù)雜的過(guò)程，并非靠個(gè)別酶就能完成，對(duì)于花青素生物合成途徑中其他結(jié)構(gòu)基因以及調(diào)控基因的研究也十分重要，因此在以后的三色堇花色形成機(jī)理研究中可以結(jié)合其他的影響因子綜合考慮。

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Cloning and bioinformatics analysis of three structural genes involved in anthocyanin synthesis ofViola×wittrockiana

GONG Sheng,SUN Hai-yan,ZHANG Ke,ZENG Yuan,LI Jing,WANG Jian,LI Xin-guo

(KeyLaboratoryofProtectionandDevelopmentUtilizationofTropicalCropGermplasmResources,MinistryofEducation,CollegeofHorticulture&LandscapeArchitecture,HainanUniversity,Haikou，Hainan570228,China)

【Objective】 Cloning and bioinformatics analysis were conducted for three genes,VwCHS,VwCHIandVwF3H,which are involved in anthocyanin synthesis of pansy.【Method】 The full-length cDNA ofVwCHS,VwCHIandVwF3Hwere cloned by RACE/PCR,and bioinformatics analysis was carried out through online software.【Result】 The full-length cDNA ofVwCHS,VwCHIandVwF3Hwere 1 481,975 and 1 361 bp,respectively.Multiple sequence alignment revealed that the amino acids encoded by the three structural genes had high identity compared to other plants (62%-90%).There were four active sites (Cys171,Phe222,His310,and Asn343) in the amino acids sequences of CHS,four active sites (Thr50,Tyr108,Asn115,and Ser192) in CHI,and five active sites (Asp218,His253,Arg215,Arg284,and Ser286) in F3H.Their molecular weights were 9.91,5.37 and 4.1 ku,and their pI values were 5.02,5.16 and 5.44,respectively.The secondary structure prediction revealed that the secondary structures of VwCHS and VwCHI protein mainly contained α helix with ratios of 43.39% and 41.89% respectively, while VwF3H protein was mainly random coil with a ratio of 42.30%.Phylogenic analysis showed that each of the three proteins belonged to the corresponding protein family cluster.【Conclusion】 VwCHS,VwCHI and VwF3H were non-transmembrane proteins without signal peptide.

Viola×wittrockiana;chalcone synthase (CHS);chalcone isomerase (CHI);flavanone-3-hydroxylase (F3H);bioinformatics analysis;gene clone

2014-12-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060265，31260488)；海南大學(xué)中西部計(jì)劃學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(ZXBJH-XK008)

龔 勝(1989-)，男，四川資陽(yáng)人，在讀碩士，主要從事園林植物資源與遺傳改良研究。E-mail：156217591@qq.com

王 健(1977-)，男，湖北宜昌人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事園林植物分子生物學(xué)研究。 E-mail：wjhnau@163.com

時(shí)間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.010

Q785

A

1671-9387(2015)07-0133-10

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