田云芳,袁秀云，蔣素華，馬 杰，蘇金樂，崔 波

(1 鄭州師范學院 a 生命科學學院，b 生物研究所，河南 鄭州 450000；2 河南農(nóng)業(yè)大學 林學院，河南 鄭州 450000)

蕙蘭CfMADS1基因的克隆及其時空表達特性

田云芳1a，2,袁秀云1b，蔣素華1b，馬 杰1b，蘇金樂2，崔 波1b

(1 鄭州師范學院 a 生命科學學院，b 生物研究所，河南 鄭州 450000；2 河南農(nóng)業(yè)大學 林學院，河南 鄭州 450000)

【目的】 對蕙蘭CfMADS1基因cDNA全長進行克隆和時空表達特性研究，為研究成花相關(guān)基因的功能提供參考。【方法】 以蕙蘭萼片cDNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR和RACE的方法，克隆獲得CfMADS1全長cDNA序列，并對其進行生物信息學分析。以蕙蘭各時期的器官組織為材料，利用熒光定量PCR進行該基因的時空表達分析。【結(jié)果】 成功克隆了CfMADS1基因(GenBank登錄號為KC148540)，其cDNA序列全長1 061 bp，開放閱讀框長744 bp，編碼247個氨基酸，分子式為 C1 244H2 040N370O377S9。其編碼的氨基酸序列與AP1/FUL亞家族中金釵石斛MADS1具有較高的同源性 (85.43%)，與AP1/FUL轉(zhuǎn)錄因子亞家族中的蛋白聚為一類。該基因編碼蛋白沒有明顯的信號肽和跨膜域，極可能位于細胞核內(nèi)，具有MADS保守域(1-61aa)和相對保守的K區(qū)(87-178aa)，而且在C末端具有AP1/FUL特征基序(LPPWML)，二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋所占比例較高 (55.63%)，三級結(jié)構(gòu)與月季、水稻和水仙MADS1蛋白結(jié)構(gòu)非常相似。該基因在盛花期葉中表達最強烈，花蕾期葉、葶、蕾及營養(yǎng)期葉、盛花期葶中表達較為強烈，子房和營養(yǎng)期根中表達較弱，其余器官組織中表達痕量?！窘Y(jié)論】 從蕙蘭萼片中克隆得到了CfMADS1 cDNA全長序列，CfMADS1與蕙蘭的成花誘導、花發(fā)育以及果實形成有關(guān)。

蕙蘭；AP1/FUL-like基因；時空表達

ABCDE花發(fā)育模型中大部分基因都屬于MADS-box 基因，MADS-box 基因是很大的一個轉(zhuǎn)錄因子家族，在真核生物的發(fā)育過程中有著重要的作用。MADS-box轉(zhuǎn)錄因子中都含有一個大約由60個氨基酸組成的高度保守的結(jié)構(gòu)域(被稱作MADS-box 結(jié)構(gòu)域)及I區(qū)(不太保守)和大約70個氨基酸殘基K區(qū)(相對保守)，C末端最不保守[1]。擬南芥中AP1(APETALA1)和FUL(FRUITFULL) 基因是植物特有的MADS-box基因，屬于植物花發(fā)育基因中的A類基因。AP1和FUL序列具有很高的相似性，屬于AP1/FUL基因亞家族。擬南芥中AP1和FUL基因在決定花分生組織方面功能冗余，但AP1基因在決定花萼花瓣形成方面及FUL基因決定果實形成方面功能相互獨立。AP1基因作為A類基因決定花萼花瓣形成的功能被認為是十字花科植物所特有的[2]。

AP1/FUL亞家族基因發(fā)生多次基因復(fù)制事件后，基因功能開始分化。如蘋果中AP1-like基因MdMADS5僅在花萼中特異表達，主要參與萼片的形成[3]；罌粟和花菱草的FUL-like基因在側(cè)芽分生組織生長、花分生組織決定、花萼形成和果實發(fā)育中都扮演著不同的角色，罌粟FUL-like基因還有調(diào)控開花時間和決定花瓣形成的功能[2]。

研究表明，MADS-box基因不僅參與花器官的形成，還與根的發(fā)育[4]、花的起始、花分生組織的決定[5]、胚的形成[6]及種子和果實的發(fā)育[7-8]有關(guān)，甚至某個基因在不同的發(fā)育階段有著不同的功能[9]。Yu等[10]從石斛蘭(Dendrobiumgrex)成花轉(zhuǎn)變時期的莖尖分生組織中克隆了3個MADS-box基因DOMADS1(屬于AGL2亞家族)、DOMADS2(屬于SQUA亞家族)和DOMADS3(屬于AGL2亞家族)，其中DOMADS1在花序分生組織和花原基中轉(zhuǎn)錄表達，之后定位于所有的花器官中；DOMADS2在整個成花轉(zhuǎn)變過程中表達，后來在蕊柱中表達；DOMADS3在成花轉(zhuǎn)變早期及后期花葶中表達。

蕙蘭(Cymbidiumfaberi)，花姿秀麗，香味濃郁，具有很高的觀賞價值。蕙蘭花發(fā)育是由多個調(diào)控途徑的基因相互協(xié)調(diào)而控制的，其調(diào)控過程極為復(fù)雜，因此對蕙蘭成花相關(guān)基因進行較為全面的深入研究有重要意義。本研究采用RT-PCR和RACE方法，克隆得到蕙蘭花發(fā)育相關(guān)基因CfMADS1的cDNA全長序列，對其進行了相關(guān)的生物信息學分析，并通過熒光定量PCR研究了蕙蘭CfMADS1開花相關(guān)基因的時空表達特性，以期為研究蕙蘭成花相關(guān)機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

以蕙蘭(Cymbidiumfaberi)營養(yǎng)期、花蕾期、盛花期的根、葉、葶、花蕾、花萼、花瓣、唇瓣、蕊柱和子房為材料，樣品在液氮中速凍后，置-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

試劑：Trizol購于Invitrogen公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa Prime ScriptTMRT-PCR Kit)、DNA去除反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRⅡ熒光定量PCR試劑盒、克隆載體 pMD19-T vector、DNA Marker DL2000、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞均購于TaKaRa生物公司，IPTG、X-gal購于上海生工公司，DNA凝膠回收試劑盒購于天根生物技術(shù)公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器：紫外分析儀(北京六一)、高速冷凍離心機(Eppendorf)、梯度PCR儀(Biometra)、凝膠成像系統(tǒng)(Uvitec)、電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒)、制冰機(上海田楓)、微量紫外分光光度計(美國，Quawell Q5000)和熒光定量PCR儀(Eppendorf)。

1.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

在Trizol方法基礎(chǔ)上提取RNA，并加以改進：樣品的起始量與提取緩沖液的比例在1∶10(質(zhì)量體積比)左右；體積分數(shù)75%乙醇沖洗2次；-20 ℃異丙醇沉淀RNA 5～10 min、10 000 r/min離心10 min，分別提取蕙蘭各器官組織總RNA后，用DEPC水稀釋，用核酸蛋白分析儀測定其OD260、OD280值，測定RNA濃度和純度，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司)和DNA去除反轉(zhuǎn)錄試劑盒，合成cDNA第一鏈。反應(yīng)產(chǎn)物于-20 ℃保存。

1.4 蕙蘭CfMADS1全長cDNA的克隆

根據(jù)高度保守的區(qū)段，利用Primer premier5.0生物軟件設(shè)計簡并引物(表1)AP1 引物對，以蕙蘭萼片RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系20 μL：ddH2O 11.7 μL，10×PCR Buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，模板cDNA 1 μL，10 μmol/L上下游特異引物各1 μL，0.5 UTaq酶 0.2 μL。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，然后以94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s進行35個循環(huán)，于72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后進行EB染色20 min，紫外光下將目的條帶迅速切下，進行凝膠回收(按照DNA凝膠回收試劑盒說明進行)，最終得到回收產(chǎn)物30 μL，取3 μL檢測濃度。取回收產(chǎn)物4 μL克隆到載體pMD19-T上，構(gòu)建重組質(zhì)粒(按說明書進行操作)。將重組質(zhì)粒進行熱擊(42 ℃)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α，涂布于含有Amp、IPTG和X-gal的固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置暗培養(yǎng)14 h左右，進行重組子篩選后送英駿公司測序。根據(jù)已確定的核苷酸序列保守區(qū)段，設(shè)計合成上下游巢式引物各2個，并與 5′RACE(Clontech)、3′RACE(TaKaRa)試劑盒中的引物相結(jié)合，克隆該已知序列的5′和3′端(5′RACE和3′RACE具體步驟按照說明書進行)。PCR產(chǎn)物回收后經(jīng)pMD19-T載體克隆、英駿公司測序，使用DNAMAN軟件與已知序列拼接，獲得該基因的cDNA全長序列。

1.5 蕙蘭CfMADS1基因的生物信息學分析

利用DNAMAN軟件進行核苷酸序列的拼接，分析氨基酸序列同源性，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；利用NCBI尋找開放閱讀框，進行BLAST比對，登錄至GenBank；利用Primer premier5.0軟件進行氨基酸的推斷；利用ProtParam進行相對分子量和等電點預(yù)測；利用SignalP進行信號肽預(yù)測；利用TMHMM進行跨膜域預(yù)測；利用PSORT進行亞細胞定位；利用ExPASy進行蛋白質(zhì)的疏水性分析；利用Scanprosite進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域分析；利用SOPMA、COILS和predictprotein預(yù)測編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)；用SWISS-MODEL進行三維結(jié)構(gòu)建模。

1.6 蕙蘭CfMADS1基因的時空表達特性分析

根據(jù)熒光定量引物設(shè)計原則，在所克隆的基因序列基礎(chǔ)上設(shè)計引物，引物序列見表1。

以蕙蘭反轉(zhuǎn)錄一鏈cDNA為模板，利用SYBRⅡ熒光定量PCR試劑盒進行RT-PCR，將所得到的條帶進行大小比對，回收、純化、連接，送英駿公司測序。

以UBQ3和ACT作為內(nèi)參基因，進行各目的基因的表達水平檢測。每個器官組織對應(yīng)的樣品設(shè)3個重復(fù)。利用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕙蘭RNA的提取

將所提取的蕙蘭各個器官組織樣品RNA進行凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，28S、18S、5S條帶均出現(xiàn)，且28S比18S略亮，18S比5S亮，推斷所提取的RNA質(zhì)量較高，比較完整，沒有其他雜質(zhì)，且沒有降解。

2.2 蕙蘭CfMADS1基因的克隆

以蕙蘭萼片RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以特異引物AP1 Forward和Reverse為引物，進行中間片段的PCR擴增，經(jīng)凝膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒、測序，得到1條基因片段，其核苷酸序列大小為376 bp(圖1a)。

將所得到的目的基因片段經(jīng)BLAST同源性比對顯示，該片段的核苷酸序列與石斛蘭(AF198175、EF535598、AY927236、DQ462469)、蝴蝶蘭(JQ065097、DQ104327)AP1/FUL亞家族基因核苷酸序列的同源性均在85%以上，表明已克隆出蕙蘭AP1/FUL亞家族基因的部分cDNA序列。

根據(jù)該基因的保守區(qū)片段序列，設(shè)計特異引物AP14ro-315和AP14ri-127及AP14fo-141和AP14fi-291，結(jié)合試劑盒中的內(nèi)外引物進行5′與3′端的巢式PCR擴增，結(jié)果表明，5′與3′端分別長265(圖1b)和633 bp(圖1c)，且均與原始序列有部分重疊。進行序列拼接后，得到該基因的cDNA全長。

2.3 蕙蘭CfMADS1基因的序列分析

CfMADS1 cDNA全長1 061 bp，包含1個起始密碼子ATG和1個終止密碼子TAA，開放閱讀框(ORF)長744 bp，編碼 247個氨基酸，有1個poly(A)結(jié)構(gòu)尾巴，3′UTR為200 bp，5′UTR為117 bp(圖2)。

2.4 蕙蘭CfMADS1蛋白的同源性及系統(tǒng)進化分析

對蕙蘭CfMADS1編碼的氨基酸殘基序列進行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，其與其他植物的AP1/FUL亞家族同源類似物有較高的同源性。用DNAMAN進行多重序列比對表明，M區(qū)同源性最高，K區(qū)較高，I區(qū)不高，C末端變化較大，且該氨基酸序列具有單子葉植物中AP1同源類似物的LPPWML保守基序。蕙蘭與其他植物如金釵石斛MADS1(ABQ08573)、朵麗蝶蘭MADS1(AFD36437)、蝴蝶蘭AP1(AAZ76263)、華山姜APETALA1(ABS83558)、油棕MADS(AAQ03221)、紫六出花APETALA1(BAL70391)的氨基酸序列均有較高的同源性，其中蕙蘭與金釵石斛MADS1的同源性最高，達到85.43%(圖3)。

在多重比對的基礎(chǔ)上，構(gòu)建CfMADS1與其他植物AP1/FUL亞家族氨基酸序列系統(tǒng)進化樹，結(jié)果(圖4)表明，朵麗蝶蘭MADS1和蝴蝶蘭AP1聚為一束，金釵石斛MADS1和球花石斛FUL1聚為一束，然后再和石斛蘭DOMADS2聚為一束，呈現(xiàn)出一定的的種屬特性, CfMADS1屬于AP1/FUL亞家族，CfMADS1的進化樹分析結(jié)果基本符合植物分類學的APG分類系統(tǒng)。

2.5 蕙蘭CfMADS1蛋白的生物信息學分析

利用ProtParam預(yù)測CfMADS1蛋白的分子式為 C1 244H2 040N370O377S9，分子質(zhì)量為28.50 ku，理論等電點為9.63，帶正電殘基(Arg+Lys)32個(占總氨基酸的17.0%)，負電殘基(Asp+Glu)30個(占總氨基酸的12.1%)。肽段中有5個半胱氨酸殘基，含量較高的依次是亮氨酸(13.4%)、谷氨酸(10.1%)、絲氨酸(10.1%)和賴氨酸(10.1%)，亮氨酸、谷氨酸和絲氨酸的含量與蕙蘭CfAP11中的相應(yīng)氨基酸殘基含量(分別為13.2%,9.4%,9.4%)[11]接近。N端為1個蛋氨酸殘基。推算其半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為55.80，脂溶指數(shù)為83.00，總平均親水指數(shù)為-0.791，理化參數(shù)與CfAP11[11]接近。

信號肽分析表明，CfMADS1沒有明顯的信號肽，不是分泌性蛋白；利用TMHMM跨膜域分析表明，該蛋白沒有明顯的跨膜域； PSORT預(yù)測結(jié)果表明，CfMADS1極可能位于細胞核內(nèi)(可能性為76.0%)。CfMADS1疏水性最大值為2.089，位于第45個氨基酸殘基；最小值為-2.589，位于第141個氨基酸殘基，總體來看大部分區(qū)域為親水區(qū)，由此推斷，CfMADS1可能是不穩(wěn)定的親水性蛋白。

SOPMA預(yù)測表明，CfMADS1蛋白由55.63%的α螺旋、10.53%的延伸鏈、32.79%的無規(guī)則卷曲和4.05%的β轉(zhuǎn)角構(gòu)成，α螺旋和無規(guī)則卷曲所占比例較高。

在Scanprosite數(shù)據(jù)庫中進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析預(yù)測，結(jié)果顯示，CfMADS1含有高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域(1-61aa)和中度保守的K區(qū)(88-178aa)。通過SWISS-MODEL在線同源建模進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)CfMADS1模型與月季(FJ970028.1)、水稻(AF058698.1)和水仙(JN704304.1)的結(jié)構(gòu)相似度很高。

2.6 蕙蘭CfMADS1基因的時空表達特性

本研究以UBQ3、ACT同時為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt法對目的基因CfMADS1的相對表達水平進行分析，結(jié)果見圖5。圖5表明，CfMADS1基因在盛花期葉中表達最強烈，花蕾期葉、葶、蕾和營養(yǎng)期葉及盛花期葶中表達較為強烈，子房和營養(yǎng)期根中表達較弱，其余器官組織中表達痕量。

對于根來說，營養(yǎng)期根中表達量高于花蕾期。對于葉來說，從營養(yǎng)期到花蕾期再到盛花期，表達量依次升高。對于花葶來說，花蕾期和盛花期表達量都較高。對于花器官來說，該基因表達微弱。在營養(yǎng)期葉、根和花蕾期葉器官中均有表達，表明該基因與花的誘導和花的起始有關(guān)；在花蕾期葶、花蕾中都有較高水平的表達，說明其可能與花器官的發(fā)育和花器官的形成有關(guān)，也可能是花蕾中該基因的部分mRNA通過花葶運輸而進行表達；在盛花期葉中高度表達，葶中表達水平也較高，說明盛花期該基因與前兩個時期相比得到了較高水平的表達；盛花期子房中也有一定水平的表達，說明該基因以某種機制參與蕙蘭果實的形成，這與CfAP11與蕙蘭果實形成關(guān)系密切的結(jié)果[11]是一致的。

3 討 論

許多研究表明，AP1-like基因主要參與調(diào)控花序分生組織向花分生組織的轉(zhuǎn)變，控制花萼花瓣形成。AP1/FUL-like基因的表達與果實的形成密切相關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，蕙蘭的AP1-like基因CfMADS1在營養(yǎng)期和花蕾期葉中均有表達，說明具有促進成花轉(zhuǎn)變、提前開花的作用；在花蕾期花葶和花蕾中表達水平較高，說明該基因可能與花器官的發(fā)育和形成有關(guān)，且可能通過花葶運輸?shù)交ɡ僦胁糠直磉_；在盛花期葉和花葶中表達水平較高，子房中也有一定水平的表達，說明該基因可能以某種機制參與果實的發(fā)育和形成，且通過葉和花葶向子房中積累，以逐漸形成蕙蘭的果實，這與AP1/FUL亞家族基因參與果實的形成密切相關(guān)。該結(jié)果與蘋果MdMADS12在花蕾、未開花時葉、花期葉及營養(yǎng)枝中的表達特性[13]較為相似；而與文心蘭OMADS10僅在營養(yǎng)期葉、唇瓣和心皮中表達的結(jié)果[14]不一致。

CfMADS1與CfAP11表達特性相似的是，在營養(yǎng)期和花蕾期葉中表達水平均較高，在盛花期的花葶和子房中的表達水平也較高，而在花器官的花萼、花瓣、唇瓣及蕊柱中表達較弱[11]。CfAP11與CfMADS1具有相似的表達特性，可能是二者在蕙蘭植株內(nèi)功能冗余的原因。

[1] Egea-Cortines M,Saedler H,Sommer H.Ternary complex formation between the MADS-box proteins SQUAMOSA,DEFICIENS and GLOBOSA is involved in the control of floral architecture inAntirrhinummajus[J].EMBO J,1999,18(19):5370-5379.

[2] Pabón-Mora N,Ambrose B A,Litt A.PoppyAPETALA1/FR-UITFULLorthologs control flowering time,branching,perianth identity,and fruit development [J].Plant Physiology,2012,158(4):1685-1704.

[3] Kotoda N,Wada M,Komori S,et al.Expression pattern of hom-ologues of floral meristem identity genesLFYandAP1 during flower development in apple [J].Journal of the American Society for Horticultural Science,2000,125(4):398-403.

[4] Alvarez-Buylla E R,Liljegren S J,Pelaz S,et al.MADS-box ge-ne evolution beyond flowers:Expression in pollen,endosperm,guard cells, roots and trichomes [J].The Plant Journal,2000,24(4):457-466.

[5] Weigel D,Nilsson O.A developmental switch sufficient for flo-wer initiation in diverse plants [J].Nature,1995,377(6549):495-500.

[6] Perry S E,Lehti M D,Fernandez D E.The MADS-domain protein AGAMOUS-like 15 accumulates in embryonic tissues with diverse origins [J].Plant Physiology,1999,120(1):121-129.

[7] Buchner P,Boutin J P.A MADS box transcription factor of theAP1/AGL9 subfamily is also expressed in the seed coat of pea (Pisumsativum) during development [J].Plant Mol Biol,1998,38(6)：1253-1255.

[8] Gu Q,Ferrándiz C,Yanofsky M F,et al.TheFRUITFULLMADS-box gene mediates cell differentiation during Arabidopsis fruit development [J].Development,1998,125(8):1509-1517.

[9] Sung S K,Yu G H,Nam J,et al.Developmentally regulated expression of two MADS-box genes,MdMADS3 andMdMADS4,in the morphogenesis of flower buds and fruits in apple [J].Planta,2000,210(4):519-528.

[10] Yu H,Goh C J.Identification and characterization of three orchid MADS-box genes of theAP1/AGL9 subfamily during floral transition [J].Plant Physiology,2000,123(4):1325-1336.

[11] 田云芳,袁秀云,蔣素華,等.蕙蘭MADS基因APETALA1/FRUITFULL-like的克隆和時空表達特性 [J].生物工程學報,2013,29(2):203-213.

Tian Y F,Yuan X Y,Jiang S H,et al.Molecular cloning and spatiotemporal expression of anAPETALA1/FRUITFULL-like MADS-box gene from the orchid (Cymbidiumfaberi) [J].Chinese Journal of Biotechnology,2013,29(2):203-213.(in Chinese)

[12] Sung S K,An G.Molecular cloning and characterization of a MADS-box cDNA clone of the Fuji apple [J].Plant and Cell Physiology,1997,38(4):484-489.

[13] Van der Linden C G,Vosman B,Smulders M J M.Cloning and characterization of four apple MADS box genes isolated from vegetative tissue [J].Journal of Experimental Botany,2002,53(371):1025-1036.

[14] Chang Y Y,Chiu Y F,Wu J W,et al.Four orchid (OncidiumGower Ramsey)AP1/AGL9-like MADS box genes show novel expression patterns and cause different effects on floral transition and formation inArabidopsisthaliana[J].Plant and Cell Physiology,2009,50(8):1425-1438.

Cloning and spatiotemporal expression ofCfMADS1 gene in orchid (Cymbidiumfaberi)

TIAN Yun-fang1a,2，YUAN Xiu-yun1b，JIANG Su-hua1b，MA Jie1b，SU Jin-le2，CUI Bo1b

(1 aCollegeofLifeScience，bInstituteofBiotechnology,ZhengzhouNormalUniversity,Zhengzhou,Henan450000,China2CollegeofForestry,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan450000,China)

【Objective】 This study cloned a full-lengthAPETALA1/FRUITFULL-like (AP1/FUL-like) MADS box cDNA fromCymbidiumfaberiand analyzed its spatiotemporal expression to provide a reference for studying function of flower related genes.【Method】CfMADS1 gene was isolated from sepals ofC.faberiby RT-PCR and RACE.Then spatiotemporal expression was detected by real time PCR.【Result】CfMADS1 gene was cloned (GenBank number:KC148540).The full length of cDNA sequence is 1 061 bp,with open reading frame of 744 bp,encoding 247 amino acids.The molecular formula is C1 244H2 040N370O377S9.The deduced amino acid sequence ofCfMADS1 shared 85.43% homology with a member of theAP1/FUL-like group of MADS box genes (DendrobiumnobileMADS1).CfMADS1 belonged to theAP1/FULtranscription factor subfamily.The deduced protein has no obvious signal peptide and transmembrane domain,and probably located in the nucleus.It had a MADS domain (1-61aa),a relatively conservative K region(87-178aa)and a C terminal conserved motif LPPWML.The secondary structure of CfMADS1 mainly consisted of alpha helices (55.63%),and the three-dimensional structure of the protein was similar to that of homologues inRozahybrida,OryzasativaandNarcissustazetta.Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) results revealed low levels of its mRNA in ovaries and roots during vegetative period,and in other tissues.Highest levels ofCfMADS1 expression were observed in leaves at full-blossom stage followed by pedicels at reproductive period,leaves at vegetative period,and leaves,pedicels,and buds at bud stage.【Conclusion】 A full-lengthAP1/FUL-like MADS box cDNA was cloned fromC.faberisepals andCfMADS1 involved in floral induction,floral development and fruit formation.

Cymbidiumfaberi;AP1/FUL-like gene;spatiotemporal expression

2014-01-06

河南省科技攻關(guān)項目(092102110128)；河南省教育廳科學技術(shù)研究重點項目(14A22005)

田云芳(1978-)，女，河南滎陽人，講師，博士，主要從事園林植物資源與利用研究。E-mail:tianyunfang2011@163.com

時間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.012

Q786

A

1671-9387(2015)07-0143-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.012.html