趙永林，宋錦寧，馬旭東，張斌飛，張明，李丹東，龐宏剛

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061)

◇專題研究◇

大鼠彌漫性軸索損傷后大腦皮層rab10的表達(dá)及意義

趙永林，宋錦寧，馬旭東，張斌飛，張明，李丹東，龐宏剛

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061)

目的 研究大鼠彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury, DAI)后小G蛋白rab10在大腦皮層的表達(dá)變化規(guī)律，探討DAI后rab10在神經(jīng)修復(fù)中的作用及意義。方法 采用頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)損傷裝置建立大鼠DAI模型，隨機(jī)分為1 d、3 d、7 d組及對(duì)照組。采用Gless嗜銀染色和TUNEL染色分別觀察DAI后神經(jīng)軸索形態(tài)和凋亡變化；采用Western blot、免疫組化等方法檢測(cè)大鼠大腦皮層rab10的分布及表達(dá)，并采用免疫熒光雙標(biāo)染色分析大腦皮層神經(jīng)元內(nèi)rab10的表達(dá)變化。結(jié)果 嗜銀染色顯示DAI后1 d神經(jīng)軸索形態(tài)損傷最嚴(yán)重，3～7 d時(shí)損傷逐漸減輕；TUNEL染色顯示DAI后1 d凋亡細(xì)胞數(shù)開始升高，3～7 d時(shí)凋亡數(shù)量更高，呈遲發(fā)性改變。Western blot及免疫組化結(jié)果均提示DAI后1 d大腦皮層rab10的表達(dá)顯著增加，3 d后稍降低，7 d后明顯降低，但仍高于正常(P<0.05)；免疫熒光雙標(biāo)染色提示正常神經(jīng)元內(nèi)幾乎不表達(dá)rab10，DAI后神經(jīng)元內(nèi)rab10表達(dá)在1～3 d較高，7 d時(shí)較前降低。結(jié)論 大鼠DAI后大腦皮層rab10表達(dá)水平先增加，隨后降低；神經(jīng)元內(nèi)rab10的表達(dá)變化可能與DAI后神經(jīng)軸索修復(fù)有關(guān)。

彌漫性軸索損傷；rab10；神經(jīng)元；皮層；大鼠；顱腦損傷；細(xì)胞凋亡

腦損傷后神經(jīng)修復(fù)和結(jié)構(gòu)的重塑，一直是神經(jīng)科學(xué)和康復(fù)科學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。彌漫性軸索損傷后受損軸索的修復(fù)和再生是保證患者預(yù)后良好的關(guān)鍵，但內(nèi)源性修復(fù)的機(jī)制仍不明確。Rab家族是小G蛋白家族的一個(gè)亞族，與其他分子結(jié)合后一起參與調(diào)控囊泡運(yùn)輸和籠形蛋白的形成，在囊泡介導(dǎo)的內(nèi)吞及合成蛋白質(zhì)的運(yùn)輸過程中有重要作用。Rab10是Rab家族的一員，在神經(jīng)元發(fā)育過程中參與調(diào)控軸突生長(zhǎng)及神經(jīng)元的極化。神經(jīng)元內(nèi)膜性囊泡沿著有極性的微管調(diào)控軸漿運(yùn)輸，DAI后微管丟失導(dǎo)致軸漿膜性囊泡快速運(yùn)輸障礙，從而加劇特征性軸索腫脹。Rab10作為細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控者，其在DAI后的表達(dá)變化及意義尚不明確，本研究采用頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)損傷建立大鼠DAI模型，觀察DAI后神經(jīng)軸索形態(tài)變化及細(xì)胞凋亡情況，并檢測(cè)DAI后大腦皮層rab10的變化趨勢(shì)，探討DAI后rab10表達(dá)變化的意義，進(jìn)一步揭示DAI的病理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑和儀器 相同遺傳背景的健康成年雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量250～300 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，該實(shí)驗(yàn)倫理經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。蛋白提取試劑盒(中杉金橋，中國(guó))；rab10兔多克隆抗體(博奧森，中國(guó))；neuN小鼠單克隆抗體(Millipore，美國(guó))；辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(Santa Cruz，美國(guó))；FITC、CY3標(biāo)記的羊抗兔/小鼠熒光二抗(博奧森，中國(guó))；PVDF膜(Millipore，美國(guó))；凝膠成像系統(tǒng)(JS-380A，中國(guó))；圖像采集與分析系統(tǒng)(Leica-Q550CW，德國(guó))；熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)；SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件(美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 選取健康成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組，假手術(shù)組30只，模型組又分為傷后1 d、3 d、7 d亞組，每亞組30只。

1.3 大鼠DAI模型的建立

研制的大鼠頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)損傷裝置制備大鼠DAI模型：各組大鼠經(jīng)100 g/L水合氯醛麻醉(0.2～0.3 mL/100 g)后，固定于旋轉(zhuǎn)裝置上。模型組大鼠蘇醒后出現(xiàn)較劇烈掙扎，在掙扎間歇期，按動(dòng)扳機(jī)，致其頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)90°，重復(fù)8次。假手術(shù)組大鼠蘇醒后即從裝置上卸下。模型組在預(yù)定時(shí)間、假手術(shù)組在觀察6 h后，用100 g/L水合氯醛腹腔麻醉，快速開胸，左心室插管至主動(dòng)脈，灌注9 g/L生理鹽水至流出液清亮后，換40 g/L多聚甲醛溶液灌注，灌注完成后迅速取腦。

1.4 Gless嗜銀染色 各組大鼠于預(yù)定時(shí)間點(diǎn)灌注生理鹽水及40 g/L多聚甲醛后取腦，標(biāo)本置于多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定48 h。常規(guī)石蠟包埋，切片厚10 μm，常規(guī)脫蠟、梯度乙醇水化。蒸餾水浸泡，5 min×3次，37 ℃ 200 g/L硝酸銀溶液避光浸染3 h，蒸餾水清洗；100 mL/L甲醛溶液還原，5 min×2次后蒸餾水浸泡，擦干水分，置于銀氨溶液內(nèi)避光浸染37 ℃，4 min。100 mL/L甲醛溶液還原如前，蒸餾水清洗，50 g/L硫代硫酸鈉固定5 min，常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。于Leica-Q550CW圖像采集與分析系統(tǒng)上采集、分析圖片。

1.5 TUNEL染色 各組大鼠于預(yù)定時(shí)間點(diǎn)灌注取腦，方法如前。常規(guī)石蠟包埋，切片厚4 μm，常規(guī)脫蠟、梯度乙醇水化。按照TUNEL凋亡試劑盒提供步驟進(jìn)行TUNEL染色。于Leica-Q550CW圖像采集與分析系統(tǒng)上采集、分析圖片，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算TUNEL陽性神經(jīng)元。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)rab10表達(dá) 取石蠟切片，厚4 μm，脫蠟水化如前，高壓修復(fù)抗原。山羊血清室溫封閉30 min后，滴加兔多克隆抗rab10抗體(1∶100)，4 ℃過夜。生物素化二抗37 ℃孵育30 min后，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素37 ℃孵育30 min。DAB顯色、蘇木素溶液復(fù)染，脫水、封片。光鏡下觀察，Leica-Q550CW圖像分析系統(tǒng)采集圖像。每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野(×200)，Image-Pro Plus 6.0對(duì)rab10進(jìn)行免疫組化半定量分析。

1.7 免疫熒光雙標(biāo)染色檢測(cè)rab10的表達(dá) 生理鹽水灌注大鼠，取完整腦組織，置于液氮表面，迅速冰結(jié)成塊，保存于-80 ℃冰箱，OCT包埋，切片。切片置于冰丙酮中10 min固定，PBS清洗，5 min×3次，滴加兔多克隆抗rab10(1∶200)，小鼠單克隆抗NeuN(1∶200)，4 ℃過夜，PBS洗片，5 min×5次。滴加FITC、CY3標(biāo)記的抗兔/鼠熒光二抗(1∶200)，室溫避光孵育2 h，PBS洗片，5 min×3次。DAPI復(fù)染10 min，自來水沖洗。甘油緩沖液封片，于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。用Photoshop CS5對(duì)熒光照片merge。

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 各組大鼠于預(yù)定時(shí)間點(diǎn)灌注取腦，取皮層，加入裂解液制成組織勻漿，用Bio-Rad試劑盒測(cè)定蛋白含量，蛋白煮沸變性后取50 μg蛋白樣品，用SDS-PAGE電泳半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜放入50 g/L脫脂牛奶中，37 ℃封閉2 h，加入rab10(1∶500)，β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG(1∶5 000)和抗鼠IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜3次，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法觀察顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Quantity One 4.6軟件作定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 Gless嗜銀染色結(jié)果 假手術(shù)組和DAI組比較，腦組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)纖維排列整齊，表面光滑。DAI后1 d，皮層內(nèi)軸索扭曲、腫脹，呈串珠狀、波浪狀改變，并可見軸索斷裂后形成的軸索收縮球，3 d時(shí)腫脹的軸索數(shù)目較前減少，軸索直徑減小，仍可見軸索球，7 d時(shí)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)較前清晰，仍有少量神經(jīng)軸索腫脹(圖1)。

2.2 DAI后細(xì)胞凋亡(TUNEL染色)情況 光鏡下可見非凋亡細(xì)胞的核呈藍(lán)色；凋亡細(xì)胞明顯固縮，核致密，深染為棕黃色，核周多有棕黃色多葉狀或新月狀顆粒；假手術(shù)組有少許細(xì)胞核被深染為棕黃色，單個(gè)高倍視野凋亡細(xì)胞數(shù)(1.23±0.57)個(gè)。DAI后1 d

開始出現(xiàn)大量TUNEL染色陽性細(xì)胞，單個(gè)高倍視野有陽性標(biāo)記細(xì)胞(15.2±2.7)個(gè)，3 d時(shí)達(dá)到(29.3±2.9)個(gè)，7 d時(shí)仍然存在大量陽性細(xì)胞(27.46±2.39)個(gè)。DAI組的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯多于假手術(shù)組，方差分析顯示各組凋亡細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=96.52，P=0.002，圖2)。

圖1 假手術(shù)組與DAI組大腦皮層Gless嗜銀染色

Fig.1 Photomicrographs by Gless’ silver impregnation technique in cerebral cortex of control rats and rats subjected to DAI

A：假手術(shù)組皮層；B～D：分別為DAI后1 d、3 d、7 d皮層。

圖2 假手術(shù)組與DAI組大腦皮層TUNEL染色

Fig.2 Photomicrographs by TUNEL staining in cerebral cortex of control rats and rats subjected to DAI

A：假手術(shù)組皮層；B～D：分別為DAI后1 d、3 d、7 d皮層。

2.3 Western blot檢測(cè)DAI后大鼠大腦皮層rab10的動(dòng)態(tài)表達(dá)結(jié)果 DAI后1 d組rab10蛋白的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，rab10蛋白的表達(dá)逐漸減少，7 d時(shí)仍高于正常(P<0.05)。方差分析顯示rab10的表達(dá)在各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=56.45，P=0.002，圖3)。

2.4 免疫組化法檢測(cè)DAI后大鼠大腦皮層rab10的分布與表達(dá) 假手術(shù)組的皮層內(nèi)有少量表達(dá)rab10表達(dá)，且染色淺淡。DAI后皮層內(nèi)rab10表達(dá)升高，胞質(zhì)內(nèi)染色深，范圍廣。DAI后1 d rab10的表達(dá)高于假手術(shù)組(P<0.05)，DAI后3 d 較1 d稍降低(P<0.05)，到了傷后7 d，rab10的表達(dá)較前明顯降低，但仍高于假手術(shù)組(P<0.05)。方差分析顯示rab10的表達(dá)在各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=148.34,P=0.001，圖4)。

圖3 DAI后不同時(shí)間點(diǎn)rab10的表達(dá)及灰度分析

Fig.3 The expression and gray value of rab10 in cerebral cortex of control rats and rats subjected to DAI

DAI組與假手術(shù)組比較，*P<0.05。

圖4 DAI后大腦皮層中rab10的表達(dá)

Fig.4 The expression of rab10 in cerebral cortex of control rats and rats subjected to DAI

A:假手術(shù)組皮層;B～D:分別為DAI后1d、3d、7d皮層。DAI組與假手術(shù)組比較,*P<0.05。

2.5 DAI后大鼠皮層rab10與neuN的免疫熒光雙標(biāo)染色 假手術(shù)組大鼠大腦皮層的rab10表達(dá)較少，DAI組rab10表達(dá)先升高，隨后降低。NeuN為神經(jīng)元的標(biāo)記物，假手術(shù)組神經(jīng)元內(nèi)幾乎不表達(dá)rab10，DAI后神經(jīng)元內(nèi)rab10的表達(dá)(黃色)呈先升高后降低的趨勢(shì)(圖5)。

圖5 大鼠彌漫性軸索損傷后不同時(shí)間點(diǎn)rab10和neuN的免疫熒光雙標(biāo)染色

Fig.5 The expression and co-localization of rab10 and neuN in rats after DAI were evaluated by immun of luorescence staining at different time

綠色熒光代表rab10，紅色熒光代表neuN，二者merge后重疊部分為黃色。

3 討 論

彌漫性軸索損傷病理過程呈進(jìn)行性發(fā)展變化，由最初軸索膜局部通透性增大和軸索內(nèi)超微結(jié)構(gòu)異常逐漸進(jìn)展為軸索遲發(fā)性斷裂，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為神經(jīng)軸索扭曲、腫脹，呈串珠狀、波浪狀改變，隨后軸索斷裂、軸索收縮球形成，軸索的形態(tài)及分子病理學(xué)改變能夠逆行引起神經(jīng)元胞體的變化，此變化可能是以細(xì)胞凋亡為主，損傷最初不明顯，隨著軸突受損后細(xì)胞內(nèi)異常的生物活動(dòng)瀑布樣爆發(fā)，呈遲發(fā)性改變[2]。本實(shí)驗(yàn)利用Gless 嗜銀染色發(fā)現(xiàn)大鼠DAI后皮層神經(jīng)軸索扭曲、腫脹、軸索斷裂、軸索收縮球形成在傷后1 d嚴(yán)重，隨后逐漸恢復(fù)。TUNEL染色顯示DAI后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，皮層凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增加，呈遲發(fā)性改變。嗜銀染色及TUNEL染色結(jié)果與既往研究結(jié)果一致[3]。

小G蛋白家族是一個(gè)GTP結(jié)合的蛋白家族，rab是其亞家族之一，以單體形式普遍存在于真核細(xì)胞中。新合成的蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)礁郀柣鶑?fù)合體及分泌性囊泡都需要載運(yùn)囊泡的參與，而rab家族參與了囊泡的形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、錨定和融合等過程[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞受到胰島素刺激后，rab10和Myosin-Va相互作用，參與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4, GLUT4)存儲(chǔ)囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)和在細(xì)胞膜上的錨定，并且rab10的效應(yīng)器GDI(guanine-nucleotide-dissociation inhibitor)-1和GDI-2在胰島素刺激后GLUT4轉(zhuǎn)位過程中也起重要作用，rab10具有維持脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素反應(yīng)的作用[6-9]。內(nèi)毒素刺激巨噬細(xì)胞后，rab10調(diào)控TLR4受體從高爾基體運(yùn)輸補(bǔ)充至細(xì)胞膜上，rab10是巨噬細(xì)胞活化所必須的[10]。

本研究通過多種實(shí)驗(yàn)方法顯示DAI后大鼠大腦皮層內(nèi)的rab10的表達(dá)明顯增加，以傷后1 d最顯著，隨著受傷時(shí)間延長(zhǎng)，rab10表達(dá)逐漸下降。免疫熒光雙標(biāo)染色顯示皮層神經(jīng)元內(nèi)rab10也有相似的變化規(guī)律。皮層神經(jīng)元內(nèi)rab10的變化趨勢(shì)與細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)似乎并不相關(guān)，rab10表達(dá)較高時(shí)，凋亡細(xì)胞數(shù)目最少，并且既往也未見rab10參與凋亡過程的報(bào)道；相反，rab10的表達(dá)變化趨勢(shì)與神經(jīng)軸索形態(tài)變化一致，在神經(jīng)軸索損傷嚴(yán)重的時(shí)間點(diǎn)(DAI后1～3 d)，rab10的表達(dá)明顯升高，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，損傷的軸索經(jīng)過內(nèi)源性修復(fù)后形態(tài)恢復(fù)至良好(DAI后7 d)，rab10的表達(dá)降低，但仍較正常高，這種時(shí)相的一致性提示rab10可能參與了神經(jīng)軸索的修復(fù)過程，并且既往研究發(fā)現(xiàn)，rab10在軸突形成和神經(jīng)元極化過程中起核心作用，rab10在抑癌蛋白Lgl1的作用下與胞質(zhì)中的GDI解離，與Myosin Vb相互作用或與kinesin-1/JIP1形成復(fù)合體，調(diào)控質(zhì)膜前體囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)，介導(dǎo)軸突的生長(zhǎng)和神經(jīng)元極化[11-13]。此外，神經(jīng)軸索修復(fù)的過程中需要合成、運(yùn)輸大量的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，rab10參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞質(zhì)中延展和重塑，介導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的過程，并影響合成的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸[14-16]。因此，DAI后rab10的表達(dá)變化可能與神經(jīng)軸索的內(nèi)源性修復(fù)有關(guān)，并且rab10很可能通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)功能和介導(dǎo)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)參與軸突的修復(fù)和再生。

綜上，DAI后大鼠大腦皮層rab10的表達(dá)升高后逐漸降低，神經(jīng)元內(nèi)rab10有類似的變化規(guī)律。Rab10的表達(dá)變化可能與DAI后神經(jīng)軸索形態(tài)修復(fù)的過程有關(guān)。進(jìn)一步闡明rab10在DAI后神經(jīng)軸索內(nèi)源性修復(fù)中的具體機(jī)制可能揭示DAI后新的病理生理過程，并為DAI的治療提供新的思路。

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(編輯 國(guó) 榮)

Expression and significance of rab10 in the cerebral cortex of rats after diffuse axonal injury

ZHAO Yong-lin, SONG Jin-ning, MA Xu-dong, ZHANG Bin-fei, ZHANG Ming, LI Dan-dong, PANG Hong-gang

(Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To explore the dynamic expression of rab10 in rat cerebral cortex after diffuse axonal injury (DAI) and its role in DAI. Methods Rat DAI models were established by a facility developed to let the rats’ heads spin 90 degrees at the moment to cause shearing injury. Rats were randomly divided into 4 subgroups (sham-operation group and 1, 3 and 7 d groups). The morphological changes of neural and axonal injury were observed under microscopy by Gless’ silver impregnation technique. Apoptosis of neurons was observed by TUNEL. Western blot and immunohistochemistry staining were used to determine the expression of rab10 in cerebral cortex after DAI. The expression and co-localization of rab10 and neuN in rats after DAI were evaluated by double-labeling immunofluorescence staining at different time points. Results The morphological damage was most obvious at 1 d after DAI, and the damage gradually lessened from 3 d to 7 d. TUNEL staining showed that the number of apoptotic cells began to rise at 1 d after DAI, and the number of apoptosis was higher at 3 d and 7 d. The expression of rab10 increased significantly at 1 d after DAI, declined slightly after 3 d, and declined significantly at 7 d (P<0.05). The co-localization of rab10 and neuN revealed that rab10 in neurons increased during 1 and 3 d after DAI and then gradually decreased. Conclusion Rab10 expression significantly increases and then gradually deceases in cerebral cortex of rats after DAI. Changes of rab10 expression in neurons might be related to the repair of axonal morphology after DAI.

diffuse axonal injury; rab10; neuron; cerebral cortex; rat; brain injury; cell apopotosis

2014-07-17

2014-10-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30471774)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.NCET-05-0831)；陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2003C1-16) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30471774), the New-Century Excellent Talents Program of Ministry of Education (No.NCET-05-0831), and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2003C1-16)

宋錦寧. E-mail: jinnings@126.com

R651.1+5

A

10.7652/jdyxb201501002

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20141119.0845.002.html(2014-11-19)