黃廷欽，宋錦寧，李 宇，胡明軍，趙雅慧，劉曉斌，郭小葉，鄭鋒偉

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061)

◇專題研究◇

FK506對大鼠彌漫性軸索損傷后神經(jīng)元凋亡及 軸突再生相關蛋白表達的影響

黃廷欽，宋錦寧，李 宇，胡明軍，趙雅慧，劉曉斌，郭小葉，鄭鋒偉

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061)

目的 研究FK506對大鼠彌漫性軸索損傷后神經(jīng)元凋亡及軸突再生相關蛋白神經(jīng)絲蛋白200(NF200)、神經(jīng)生長相關蛋白43(GAP-43)、凋亡相關蛋白激酶1(DAPK1)表達的影響。方法 通過頭顱瞬間旋轉損傷裝置建立大鼠彌漫性軸索損傷模型，90只SD成年雄性大鼠隨機分為假手術組、DAI模型組、FK506干預組(各組又分為6 h、1 d、7 d亞組，各組n=10)；各組于預定時間點采用mNSS法評估神經(jīng)功能，免疫組化染色法檢測DAPK1、NF200的表達變化，Western blot法檢測GAP-43的表達變化、TUNEL檢測神經(jīng)元凋亡，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差記錄，使用統(tǒng)計學SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果 FK506干預組較DAI組損傷后的NF200標記軸索病理改變顯示，形成軸索腫脹、軸索球數(shù)目明顯降低；FK506干預組較DAI組各時間點DAPK1蛋白表達明顯降低，神經(jīng)元凋亡數(shù)目明顯減少，GAP-43、NF200蛋白表達明顯升高。結論 FK506能夠在DAI后減少神經(jīng)元細胞凋亡與軸索病理改變，減輕神經(jīng)組織損傷；FK506能夠加速神經(jīng)元再生，促進腦組織損傷的修復。

FK506；彌漫性軸索損傷；神經(jīng)絲蛋白200；神經(jīng)生長相關蛋白43；凋亡相關蛋白激酶1；細胞凋亡；顱腦損傷

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury, DAI)是一種公認最常見、最重要的重型顱腦損傷(traumatic brain injury, TBI)，以長時間意識障礙為典型臨床表現(xiàn)，臨床診斷較困難且預后差，社會人力、物力花費巨大。數(shù)據(jù)顯示，很多治療藥物已經(jīng)應用于臨床，但未證實有明確效果[1]。FK506是一種較強的、高效低毒的、廣泛應用于器官移植術后的免疫抑制劑，屬于神經(jīng)鈣蛋白抑制劑。目前研究證實其具有加速神經(jīng)再生和神經(jīng)損傷修復作用，依賴于其阻斷了鈣依賴性信息通道的轉導[2-4]。死亡相關蛋白激酶1(death-associated protein kinase-1, DAPK1)是一類新型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在腦缺血、腦外傷等“死亡”信號刺激下去磷酸化激活，通過多種途徑介導神經(jīng)元損傷、死亡[5-7]，而該激活過程可以被FK506抑制進而起到神經(jīng)保護作用[7]。神經(jīng)絲蛋白200(neurofilament-200, NF200)在生理情況下只存在軸索內(nèi)，不包含于神經(jīng)元胞體內(nèi)，當發(fā)生顱腦損傷后，神經(jīng)元細胞在創(chuàng)傷及其他多種誘導因子的作用下大量合成NF200，以適應神經(jīng)再生的需求，因此，它不僅可以反映神經(jīng)元功能，還可反映神經(jīng)軸突再生的情況[9]。神經(jīng)生長相關蛋白43(growth-associated protein-43, GAP-43)是脊椎動物神經(jīng)胞膜上的一種特異性磷酸蛋白，與神經(jīng)發(fā)育、軸突再生、突觸重建等密切相關的一個內(nèi)在決定因子[10]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 相同遺傳背景的成年健康雄性SD大鼠90只，體質量300～350 g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供(許可證號：SCXK(陜)2007-001)。隨機分為3組，分別于造模后6 h、1 d和7 d時間點處死大鼠(假手術組，DAI模型組，F(xiàn)K506干預組，各組n=10)；本實驗動物倫理經(jīng)西安交通大學醫(yī)學院生物倫理委員會批準。FK506[普樂可復，安斯泰來制藥(中國)有限公司]；DAPK1兔單克隆抗體(美國Abcam公司)；NF200鼠單克隆抗體、GAP-43兔多克隆抗體(武漢博士德公司)；β-actin鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；免疫組化試劑盒SP-9000/9001/9002(北京中杉金橋生物技術有限公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；TUNEL試劑盒(美國Promega公司)；圖像采集及分析系統(tǒng)(德國Leica-Q550CW)。

1.2 DAI模型制作及干預方法 本實驗DAI模型可參考本課題組前期的研究[11]，步驟簡述如下：大鼠稱重后給予100 g/L水合氯醛淺麻醉(2 mL/kg腹腔內(nèi)注射)，麻醉后頭部固定于本課題組自制大鼠頭顱瞬間旋轉損傷裝置，并調(diào)整軀干位置使之與實驗臺面間夾角保持約30°，按動扳機，使大鼠頭顱瞬間旋轉90°后又瞬間停止，造成DAI損傷，隨后復位裝置，重復打擊8次。假手術組給予淺麻醉固定后不予加速旋轉及制動，不打擊損傷，其他操作與DAI組相同。損傷后大鼠置于單獨籠子內(nèi)，保持室溫18～26 ℃，室內(nèi)相對濕度40%～70%。

FK506干預組造模后立即給予FK506(2 mg/kg，腹腔內(nèi)注射，無菌生理鹽水配制)，之后每天同時間段給予直至處死前；而假手術組、DAI模型組同時給予同體積無菌生理鹽水腹腔內(nèi)注射作為對照。

1.3 大鼠神經(jīng)功能缺損的評估 各組于術后1 d(各組n=20)按改良神經(jīng)功能嚴重程度評分表(modified neurological severity scores, mNSS)[12]評估大鼠神經(jīng)功能缺損，mNSS評分包括：運動、感覺、反射及平衡木4項測試；記分在0～18分之間(得分越高代表腦損傷越嚴重)。評分人員為2位未知分組情況的實驗員。

1.4 標本處理 每組隨機挑選5只大鼠，用水合氯醛麻醉后依次用生理鹽水、40 g/L多聚甲醛各250 mL經(jīng)心臟灌注，斷頭取腦，再經(jīng)后固定、漂洗、脫水并透明后石蠟包埋。每個腦組織塊在大腦腳水平離斷腦干與間腦部分，去除小腦組織。將大腦沿正中分為左右半球，隨機選取一側半球，分別在中線位置外2 mm連續(xù)縱切5 μm厚腦片3片；沿大腦腳水平下1 mm連續(xù)橫切5 μm厚腦片3片，各片經(jīng)脫臘、脫水后按免疫組化試劑盒、TUNEL試劑盒說明書操作。

每組剩余5只大鼠行Western blot分析。大鼠用水合氯醛麻醉后用生理鹽水250 mL經(jīng)心臟充分灌注，斷頭取腦，冰上分離出腦干，去除小腦組織；用RIPA細胞裂解液冰上裂解、離心，取上清液―20 ℃凍存，備用。

1.5 免疫組化檢測大鼠腦組織內(nèi)DAPK1、NF200的表達 采用免疫組化SP法，按試劑盒說明書操作，DAPK1、NF200的稀釋比為1∶1 000、1∶500。以細胞質或細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。每張切片400倍鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)陽性細胞。

1.6 Western blot檢測大鼠腦組織GAP43含量 提取各組大鼠(n=5)腦干組織蛋白、定量分析及蛋白質變性后，按每泳道加20 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后經(jīng)濕轉印跡法轉移至PVDF膜上，用50 g/L脫脂牛奶(TBST液配制)封閉1 h后加入1∶1 000稀釋GAP-43一抗，4 ℃孵育過夜。TBST液洗膜3次×10 min后加入辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育2 h，再次TBST液洗膜4次×10 min后，與顯色劑(A液∶B液=1∶1)于暗盒內(nèi)反應5 min，后經(jīng)膠片顯影成像、自動凝膠圖像分析儀拍照(上海培清科技JS-380A)，以MediaCybernetics公司Image-Pro Plus v6.0分析軟件系統(tǒng)進行蛋白條帶的灰度值分析。以目的蛋白GAP-43與內(nèi)參β-actin比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.7 TUNEL染色檢測大鼠神經(jīng)元細胞凋亡情況 切片經(jīng)二甲苯脫臘、乙醇水化、PBS水洗后，用蛋白酶K溶液(20 μg/mL)去除組織蛋白，加100 μL TUNEL反應混合液(處理組用1 μL rTdT+1 μL生物素標記的dUTP+98 μL平衡液混勻)于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37 ℃×1 h。而陰性對照組不加rTdT，改為三蒸水；陽性對照組先加入100 μL DNase 1緩沖液孵育5 min，甩掉液體后再加100 μL DNase 1(10 U/mL)酶切10 min，用去離子水沖洗4次，PBS浸洗5 min；浸入2×SSC 15 min終止反應；切片用PBS洗3次后滴加內(nèi)源性過氧化物酶POD封閉，浸入3 mL/L H2O23～5 min；PBS 洗滌3次后滴加100 μL streptavidin標記HRP(按1∶500 PBS稀釋)30 min；PBS洗滌3次后DAB顯色(避光)，加DAB混合液[50 μL DAB+50 μL DAB底物緩沖液+50 μL H2O2(×20)+950 μL三蒸水]10 min左右，鏡下出現(xiàn)淺棕色背景時；用蘇木素復染，梯度乙醇脫水(50、70、85、95、100、100 mL/L各1 min)、二甲苯透明1 min×2次、中性樹膠封片。加一滴PBS或甘油在視野下，用光學顯微鏡觀察凋亡細胞(共計200～500個細胞)并拍照。每張切片在高倍鏡下選取海馬、腦干位置各5個不重復的視野計數(shù)陽性細胞，5(海馬)或5(腦干)個視野總數(shù)相加為該切片陽性細胞數(shù)，同一組織部位3張切片平均值為該位置陽性細胞數(shù)，3個位置相加為該動物總陽性細胞數(shù)，最后取每組5只動物的平均值。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分 DAI模型組術后1 d大鼠mNSS評分(11.30±1.73)與假手術組(1.60±0.76)比較顯著增高(P<0.05)；FK506干預組(6.50±1.10)可以明顯降低mNSS評分，與DAI模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但仍高于假手術組(P<0.05)。

2.2 FK506對凋亡相關蛋白DAPK1表達的影響 假手術6 h、1 d及7 d組海馬、腦干區(qū)域未見明顯DAPK1棕黃色陽性細胞，呈陰性表達；而DAI模型組6 h海馬、腦干區(qū)域可見大量DAPK1棕黃色陽性細胞，染色多位于胞質內(nèi)，部分位于軸突、樹突，在損傷后1 d再次增多，到達高峰，呈強陽性表達；損傷后7 d組DAPK1陽性表達有所減少，但仍高于對照組；陽性細胞計數(shù)表明，DAI損傷組中6 h、1 d、7 d與假手術組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1～圖3)。FK506干預組6 h可見DAPK1表達陽性細胞，但明顯少于損傷組(P<0.05)；至1 d陽性細胞計數(shù)亦逐漸增多，到達高峰，但仍明顯少于損傷組(P<0.05)；FK506干預組6 h、1 d、7 d與假手術組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1～圖3)。

2.3 FK506對DAI后神經(jīng)元凋亡的影響 TUNEL染色結果顯示：假手術組在1 d時海馬、腦干區(qū)域未見明顯的陽性細胞，DAI損傷組、FK506干預組在1 d時海馬、腦干區(qū)域均見TUNEL陽性細胞，且計數(shù)均高于對照組(P<0.05)；而FK506干預組在1 d時海馬、腦干區(qū)域TUNEL陽性細胞計數(shù)明顯少于損傷組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4、圖5)。

2.4 FK506對軸突再生相關蛋白NF200表達的影響 假手術6 h、1 d及7 d組海馬、腦干區(qū)域未見明顯NF200棕黃色染色，呈陰性表達；而DAI模型組后6 h海馬、腦干區(qū)域可見大量NF200棕黃色陽性細胞，染色見于胞質、軸突及樹突，以軸突、胞質為主；在損傷區(qū)域可見大量的軸索腫脹、軸索球形成(圖6、圖7黑色箭頭示軸索腫脹，紅色箭頭示軸索球)；在損傷后1 d軸索腫脹、軸索球逐漸增多，胞質內(nèi)NF200表達亦明顯增多，呈強陽性表達；至損傷后7 d觀察軸索腫脹、軸索球有所減少，但仍高于對照組(P<0.05)，神經(jīng)元胞質內(nèi)NF200表達含量到達峰值，明顯高于對照組(P<0.05，圖6～圖9)。FK506干預組6 h亦可見大量軸索腫脹及軸索球形成，第1天到達峰值，第7天軸索腫脹及軸索球均有所減少；干預組在6 h、1 d及7 d時比較DAI損傷組軸索腫脹及軸索球均有所減少(P<0.05)；胞質內(nèi)NF200表達含量于第1天到達峰值，明顯高于DAI組及對照組(P<0.05)；至第7天干預組胞質內(nèi)NF200表達含量較DAI組未見明顯差異(P>0.05)，但較假手術組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖6～圖9)。

圖1 FK506干預后腦海馬DAPK1的表達情況

Fig.1 DAPK1 expression in the hippocampus in each group after FK506 intervention (×400)

A～C：假手術組(6 h組、1 d組、7 d組)；D～F：模型組(6 h組、1 d組、7 d組)；G～I：FK506干預組(6 h組、1 d組、7 d組)。

圖2 FK506干預后腦干DAPK1的表達情況

Fig.2 DAPK1 expression in the brain stem in each group after FK506 intervention (×400)

A～C：假手術組(6 h組、1 d組、7 d組)；D～F：模型組(6 h組、1 d組、7 d組)；G～I：FK506干預組(6 h組、1 d組、7 d組)。

圖3 FK506干預后DAPK1陽性細胞計數(shù)比較

Fig.3 Cell count of DAPK1-positive cells in each group after FK506 intervention

A：海馬部位DAI損傷組DAPK1陽性細胞計數(shù)與假手術組相比，*P<0.05；FK506干預組在6 h、1 d較DAI損傷組陽性細胞明顯減少，#P<0.05，但仍高于假手術組，*P<0.05。B：腦干部位DAI損傷組DAPK1陽性細胞計數(shù)與假手術組相比，*P<0.05；FK506干預組在6 h、1 d及7 d較DAI損傷組陽性細胞明顯減少，#P<0.05，但仍高于假手術組，*P<0.05。

圖4 FK506干預后海馬、腦干TUNEL染色結果比較

Fig.4 TUNEL staining of the hippocampus and brain stem in each group after FK506 intervention (×400)

A：假手術組1 d(海馬)；B：DAI模型組1 d(海馬)；C：FK506干預組1 d(海馬)；D：假手術組1 d(腦干)；E：DAI組1 d(腦干)；F：FK506干預組1 d(腦干)。

圖5 FK506干預后TUNEL陽性細胞計數(shù)比較

Fig.5 Cell count of TUNEL-positive cells in each group after FK506 intervention

與假手術組比較，TUNEL陽性細胞計數(shù)明顯升高，*P<0.05；與DAI組比較，TUNEL陽性細胞計數(shù)明顯降低，#P<0.05。

2.5 FK506對軸突再生相關蛋白GAP-43表達的影響 假手術組未見明顯GAP-43表達，而DAI組6 h、1 d及7 d時其表達明顯升高(P<0.05)；在FK506干預組中，GAP-43表達急劇升高，1 d到達峰值，且持續(xù)至7 d(P<0.05)；同時各時間點與DAI未干預組相比，GAP-43表達明顯增多(P<0.05)，提示神經(jīng)元細胞再生增多(圖10)。

圖6 FK506干預后腦海馬NF200的表達情況

Fig.6 NF200 expression in the hippocampus in each group after FK506 intervention (×400)

A～C：假手術組(6 h組、1 d組、7 d組)；D～F：DAI模型組(6 h組、1 d組、7 d組)；G～I：FK506干預組(6 h組、1 d組、7 d組)。黑色箭頭示軸索腫脹，紅色箭頭示軸索球。

圖7 FK506干預后腦干NF200的表達

Fig.7 NF200 expression in the brain stem in each group after FK506 intervention (×400)

A～C：假手術組(6 h組、1 d組、7 d組)；D～F：模型組(6 h組、1 d組、7 d組)；G～I：FK506干預組(6 h組、1 d組、7 d組)。黑色箭頭示軸索腫脹，紅色箭頭示軸索球。

圖8 FK506干預后軸索球及軸索腫脹計數(shù)結果比較

Fig.8 Comparison of the number of axonal bulbs and swollen axons in each group after FK06 intervention

A：與假手術組比較，軸索腫脹計數(shù)明顯升高，*P<0.05；與FK506干預組比較，軸索腫脹計數(shù)明顯減低，#P<0.05；B：與假手術組比較，軸索球計數(shù)明顯升高，*P<0.05；與FK506干預組比較，軸索球計數(shù)明顯減低，#P<0.05。

圖9 FK506干預后NF200陽性細胞計數(shù)比較

Fig.9 Comparison of cell count of NF200-positive cells in each group after FK506 intervention

A：海馬部位DAI損傷組、FK506干預組NF200陽性細胞計數(shù)與假手術組相比明顯升高，*P<0.05；FK506干預組在6 h、1 d及7 d較DAI損傷組陽性細胞明顯增多，#P<0.05；B：腦干部位DAI損傷組、FK506干預組NF200陽性細胞計數(shù)與假手術組相比明顯升高，*P<0.05；FK506干預組在6 h、1 d較DAI損傷組陽性細胞明顯增多，#P<0.05。

3 討 論

目前研究發(fā)現(xiàn)FK506除了用于抗排斥反應，亦可以減輕神經(jīng)組織損傷，促進顱腦外傷后神經(jīng)功能的恢復；LOPEZ-VALES等[2]通過對大鼠脊髓損傷后立刻給予FK506靜脈快速注射2 mg/kg，證實給予干預組大鼠神經(jīng)功能恢復明顯好于損傷組。FK506具有抑制神經(jīng)鈣蛋白生物活性的作用，能夠阻斷細胞內(nèi)有關鈣依賴性信號傳導通路。研究證實FK506能夠減輕TBI后病理改變，可能與其減低損傷后線粒體通透性轉換(mitochondrial permeability transition, MPT)及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin, CN)的活性有關[13]；同時也有研究發(fā)現(xiàn)FK506可以導致白介素合成減少，進而影響T淋巴細胞活化過程，減輕DAI組、DAI+FK506組較假手術組明顯升高，*P<0.05；FK506干預組較DAI組表達明顯升高，#P<0.05。

圖10 FK506干預后腦干GAP-43蛋白表達含量比較

Fig.10 The expression of GAP-43 in the brainstem of each group after FK06 intervention

T淋巴細胞對損傷組織浸潤和破壞，從而起到保護神經(jīng)組織、加速神經(jīng)再生、促進神經(jīng)功能恢復的作用[2-4]，并且其抑制炎癥反應及淋巴細胞浸潤作用效果要優(yōu)于甲潑尼龍[14]。本研究對大鼠損傷后mNSS評分結果顯示，F(xiàn)K506能夠明顯改善DAI損傷后大鼠的神經(jīng)功能障礙，提示其具有重要神經(jīng)保護作用。

在腦缺血相關研究發(fā)現(xiàn)，凋亡相關蛋白DAPK1可致腦缺血后神經(jīng)元細胞的凋亡，導致腦神經(jīng)組織損傷，而FK506能夠抑制這一過程，進而減輕腦缺血后神經(jīng)功能缺失，起到神經(jīng)保護作用[8]；我們前期研究亦發(fā)現(xiàn)，DAI后腦內(nèi)DAPK1的表達與神經(jīng)元細胞凋亡相關，為進一步研究DAPK1在DAI后神經(jīng)保護中的作用，F(xiàn)K506能夠抑制DAPK1的活性的可能機制為：DAPK1的激活需要Ca2+、鈣調(diào)蛋白(camodulin, CaM)、CN相互作用[15-16]，在細胞信號轉導過程中，CN被Ca2+和CaM激活后通過對DAPK1的去磷酸化實現(xiàn)其促神經(jīng)細胞凋亡作用機制，而CN是免疫抑制劑FK506作用靶蛋白。本研究檢測結果顯示DAI后海馬、腦干組織內(nèi)凋亡相關蛋白DAPK1表達明顯增多，同時伴有相應不同程度的神經(jīng)元凋亡，而FK506干預后DAPK1表達明顯減少，損傷后神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)目明顯降低；因此給予FK506能夠抑制DAPK1的激活與表達，減少DAI后神經(jīng)元細胞的死亡，起到神經(jīng)保護作用。同時發(fā)現(xiàn)DAI后6 h神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目開始增多，給予FK506干預組在損傷后6h神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目較損傷組已經(jīng)開始明顯減少，說明FK506能夠在DAI損傷后早期抑制DAPK1這種鈣依賴信號通路介導的神經(jīng)元細胞凋亡途徑，進而降低神經(jīng)功能的損害，起到神經(jīng)保護作用。

DAI后腦實質受不均勻的旋轉力或加減速產(chǎn)生的機械力，發(fā)生著廣泛分布的以神經(jīng)軸索變性、斷裂、軸索回縮球形成為主要病理特征的改變；本研究通過NF200免疫組化染色可以明確顯示DAI后軸索的病理改變，特別是在損傷后第1天海馬、腦干損傷區(qū)域可見大量的軸索腫脹及軸索球形成，而在假手術組未見以上的軸索病理改變。DAI模型組6 h開始出現(xiàn)大量軸索改變，一直可以持續(xù)到第7天，而給予FK506干預治療后，DAI損傷后6 h、1 d、7 d較DAI模型組軸索病理改變明顯減輕；說明FK506治療能夠修復DAI損傷導致的軸索運輸障礙，減少軸索腫脹、軸索球的形成，明顯減輕DAI后神經(jīng)組織損傷。同時NF200是特有的一種構成神經(jīng)胞體及軸樹突骨骼框架的結構蛋白，可以用作反映神經(jīng)元功能、間接指示軸突再生狀況的一個指標[17-18]，通過本實驗亦觀察到假手術組未見明顯NF200表達增多，而DAI模型組NF200在損傷后6 h開始表達增多，一直持續(xù)至第7天；然而給予FK506治療后NF200的表達高峰較DAI模型組明顯提前，DAI模型組NF200表達峰值在第7天，F(xiàn)K506干預組在第1天已經(jīng)到達峰值，說明FK506能夠加速DAI損傷后神經(jīng)細胞再生，促進神經(jīng)組織損傷的修復，其機制可能與減輕T淋巴細胞浸潤和破壞，抑制神經(jīng)元凋亡或者加速神經(jīng)元再生有關。

GAP-43是一種快速轉運胞膜磷酸蛋白，與神經(jīng)生長、發(fā)育、分化及軸突再生密切相關的一種內(nèi)在決定因子，并與軸突的生長變化一致[19]。本研究采用GAP-43作為DAI后神經(jīng)軸突再生的標記物，對各組大鼠DAI后各時點腦組織中蛋白表達情況進行觀察。發(fā)現(xiàn)假手術組未見GAP-43蛋白表達，在DAI損傷后6 h開始出現(xiàn)GAP-43表達，逐漸增多直至第7天；說明DAI損傷后存在神經(jīng)元軸突的再生；而給予FK506治療發(fā)現(xiàn)，在DAI損傷后6 h、1 d、7 d時間點GAP-43表達均高于DAI損傷組；說明FK506能夠促進損傷的神經(jīng)元大量合成GAP-43，經(jīng)胞體快速運至軸突，促進軸突生長、再生，加速神經(jīng)功能的恢復，起到神經(jīng)保護作用。其作用機制可能為：FK506能夠特異性抑制CN激活，GAP-43與鈣調(diào)素結合域脫離，暴露Ser41位點磷酸化，進而促進軸突的迅速生長，神經(jīng)的再生。

綜上，F(xiàn)K506能夠在DAI后減少神經(jīng)元損傷、死亡及軸突病理改變(軸索腫脹、軸索球形成)；FK506能夠加速神經(jīng)元細胞軸突再生，促進腦組織損傷的修復。提示FK506治療對DAI后神經(jīng)保護有著至關重要的作用。

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(編輯 國 榮)

The influence of FK506 on the expressions of proteins related to neuronal apoptosis and regeneration following diffuse axonal injury in rats

HUANG Ting-qin, SONG Jin-ning, LI Yu, HU Ming-jun, ZHAO Ya-hui, LIU Xiao-bin, GUO Xiao-ye, ZHENG Feng-wei
(Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To explore the influence of FK506 on the expressions of DAPK1, NF200 and GAP-43, proteins related to neuronal injury and regeneration following diffuse axonal injury (DAI) in rats. Methods The model of DAI by instant head rotation was produced in 90 adult male SD rats. The rats were randomly divided into three groups: sham group without injury, DAI group, and FK506 intervention group. Each group was divided into 6 h, 1 d and 7 d sub-groups with 10 rats in each. The nerve function of each group was detected by the modified neurological severity scores (mNSS) at scheduled time points. The expressions of DAPK1 and NF200 were detected using immunohistochemistry staining method; the expression of GAP-43 was detected using Western blot; and the number of the apoptotic neurons after DAI was counted by TUNEL staining. Data were expressed as the mean values ± standard deviation. All data were analyzed with the Statistical Package for the Social Sciences version 18.0. A value ofP<0.05 was considered statistically significant. Results In the FK506 intervention group, the expression of DAPK1 protein was significantly reduced, and the number of apoptotic neurons decreased significantly compared with those in the DAI group at each time point. NF200 labeled axonal pathology showed that axonal swelling and axonal ball number were decreased in the FK506 intervention group compared with the DAI group. In the FK506 intervention group, the expression of DAPK1 protein and the number of apoptotic neurons were reduced significantly at each time point; the expressions of GAP-43 and NF200 protein increased significantly compared with those in the DAI group. Conclusion FK506 can reduce the apoptosis of neurons and axon pathological changes after DAI, thus lessening nerve tissue injury. FK506 can also accelerate the regeneration of neurons and promote the repair of brain tissue injury.

FK506; diffuse axonal injury (DAI); neurofilament-200; growth-associated protein-43; death-associated protein kinase-1; apoptosis; traumatic brain injury

2014-07-15

2014-10-08

國家自然科學基金資助項目(No.30471774)；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃資助項目(No.NCET-05-0831)；陜西省自然科學基金資助項目(No.2003C1-16) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30471774), the New-Century Excellent Talents Program of Ministry of Education (No.NCET-05-0831), and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2003C1-16)

宋錦寧. E-mail: jinnings@126.com

R651.1+5

A

10.7652/jdyxb201501008

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20141119.0840.001.html(2014-11-19)