李 瑩，柳參奎

（1．東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，黑龍江哈爾濱150040；2．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)寒地作物種質(zhì)改良與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶163319）

堿茅6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析

李 瑩1，2，柳參奎1*

（1．東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，黑龍江哈爾濱150040；2．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)寒地作物種質(zhì)改良與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶163319）

從堿茅酵母cDNA文庫(kù)中經(jīng)過(guò)NaCl、Na HCO3篩選，均得到長(zhǎng)為1153 bp堿茅6-磷酸海藻糖合成酶基因（Put TPS）片段。通過(guò)3′End cDNA amplification方法獲得基因缺失的3′序列，該基因全長(zhǎng)3358 bp，編碼882個(gè)氨基酸。氨基酸序列比較結(jié)果表明，Put TPS氨基酸序列與水稻、擬南芥、玉米等多種高等植物的TPS蛋白的同源性高達(dá)60%～90%。利用Northern blot技術(shù)，研究該基因的組織表達(dá)模式及NaCl、Na HCO3脅迫處理下基因的表達(dá)模式變化；同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)p YES2-Put TPS基因酵母菌株進(jìn)行鹽、堿、氧化脅迫、滲透脅迫處理，觀察其在逆境下的生存表現(xiàn)。結(jié)果表明，Put TPS具有組織表達(dá)特異性，其中在根和花中表達(dá)量最大；NaCl、Na HCO3會(huì)誘導(dǎo)Put TPS基因在根和葉中的上調(diào)表達(dá)；同時(shí)重組酵母菌株對(duì)鹽堿、氧化、滲透脅迫及干旱等逆境的適應(yīng)能力顯著增強(qiáng)。以上研究結(jié)果表明，堿茅Put TPS基因與逆境之間具有一定的應(yīng)答關(guān)系，并在植物適應(yīng)環(huán)境逆境過(guò)程中起著重要的作用。

堿茅；6-磷酸海藻糖合成酶；基因表達(dá)；酵母

海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子以ɑ，ɑ-1，1糖苷鍵連接的非還原性雙糖，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、藻類、無(wú)脊椎動(dòng)物和植物中［1］。它是植物在逆境脅迫條件下大量積累的一類物質(zhì)，對(duì)植物抵御干旱、高溫、低溫、鹽、氧化脅迫及營(yíng)養(yǎng)缺乏等逆境至關(guān)重要［2-6］。海藻糖在生物體中的合成途徑有5種，分布最廣的通路是TPS／TPP途徑，包括兩個(gè)步驟，兩個(gè)不同的酶。植物體內(nèi)，途徑中，海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）是海藻糖的合成過(guò)程中的關(guān)鍵作用酶，即尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖在海藻糖-6-磷酸合成酶的催化作用下合成6-磷酸海藻糖（T6P），然后在海藻糖-6-磷酸酯酶（trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP）作用下生成海藻糖［7-9］。

1998年，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中一些與海藻糖生物合成相關(guān)的基因TPS和TPP被發(fā)現(xiàn)［10-11］。近期TPS和TPP的同源序列在水稻（Oryza sativa）、煙草（Nicotiana tabacum）、陸地棉（Gossypium hirsutum）及卷葉柏（Selaginella lepidophylla）等多種植物中也被發(fā)現(xiàn)［12-16］。植物中的TPS基因都以基因家族的形式存在。已測(cè)序的物種中，擬南芥中發(fā)現(xiàn)了11個(gè)TPS基因，高粱（Sorghum vulgare）中發(fā)現(xiàn)了11個(gè)TPS基因，水稻中發(fā)現(xiàn)了11個(gè)TPS基因，蓖麻（Ricinus communis）中發(fā)現(xiàn)了13個(gè)TPS基因［17-20］。根據(jù)是否與酵母TPS1具有同源性，將TPS蛋白分成了兩個(gè)具有顯著區(qū)別的類群，只有酵母TPS1屬于Class I，同時(shí)TPS的活性已經(jīng)被證實(shí)［19，21］。Class II TPS蛋白是否具有TPS活性還未被證實(shí)。

由于逆境下海藻糖對(duì)生物體的保護(hù)作用，目前研究表明，通過(guò)轉(zhuǎn)入海藻糖合成相關(guān)基因成功地改善了植物對(duì)逆境的抵御能力。OsTPS1過(guò)表達(dá)顯著提高了水稻幼苗對(duì)低溫，高鹽，干旱等逆境脅迫的耐受能力［22］。Sl TPS1基因可以有效地恢復(fù)酵母突變體tps1Δ對(duì)NaCl、Sorbital的敏感性，由此推斷Sl TPS1基因在卷柏的抗逆性方面發(fā)揮了重要作用［16］。過(guò)量表達(dá)擬南芥內(nèi)源TPSI基因的植株耐旱性也得到了提高［23］。因此與海藻糖合成的相關(guān)酶在植物抗逆性方面發(fā)揮著重要的作用。

堿茅（Puccinellia tenuiflora）是一種禾本科單子葉鹽生植物，主要分布在我國(guó)的東北松嫩鹽堿草甸草原上。與其他鹽生植物相比，它在極端鹽惡劣的鹽堿環(huán)境下p H值9～10完成其整個(gè)生命周期［24］。它具有一套獨(dú)特的適應(yīng)鹽堿逆境的生理機(jī)制，同時(shí)也具有潛在的實(shí)用價(jià)值。因此，它是一種理想的研究耐鹽機(jī)制的鹽生植物。

本研究利用3′End cDNA amplification方法，克隆得到具有完整ORF的Put TPS基因，并對(duì)該基因的組織表達(dá)模式以及在鹽、堿脅迫處理下的mRNA表達(dá)特性進(jìn)行分析；同時(shí)深入分析過(guò)表達(dá)酵母對(duì)鹽、堿、滲透、氧化等脅迫的耐受能力。試圖探討鹽、堿逆境脅迫下該基因的抗性作用，為深入理解鹽生植物抗逆機(jī)理積累資料。

1 材料與方法

1．1 植物材料

堿茅植株及種子采自東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心安達(dá)野外實(shí)驗(yàn)基地。2012年7月分離保存野外生長(zhǎng)的堿茅根、莖、葉、花、果等部分組織。同時(shí)成熟的種子經(jīng)20 mmol／L NaCl選種，選出籽粒飽滿的種子，5%NaClO3消毒5 min，無(wú)菌水洗3～5遍，25℃室溫水培養(yǎng)2周的堿茅幼苗為試材，相對(duì)濕度60%，光照6000 lx，光照時(shí)間為16 h／8 h。分別選取經(jīng)500 mmol／L NaCl、40 mmol／L Na HCO3處理0，6，12，24，48 h后，分別收集葉部組織（地上部分）、根部組織（地下部分），液氮速凍后保存。并用于后期Northern blot分析。

1．2 基因的克隆與序列分析

堿茅cDNA文庫(kù)于2008年Ta KaRa公司合成構(gòu)建于p GCAP10載體上，經(jīng)過(guò)酶切、連接將其構(gòu)建到改造的釀酒酵母表達(dá)載體p AUR101（Ta KaRa，Japan）上。利用LiAc／PEG酵母轉(zhuǎn)化法［25］，將其高效轉(zhuǎn)化到釀酒酵母菌株In VscI（Saccharomyces cerevisiae）中。通過(guò)對(duì)堿茅酵母文庫(kù)的耐鹽堿性篩選，從中均分離得到一抗性酵母克隆，通用引物PCR產(chǎn)物插入T載體測(cè)序得長(zhǎng)度為1153 bp，測(cè)序后經(jīng)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該片段為5′端的完整的堿茅6-磷酸海藻糖合成酶基因（Puccinellia tenuiflora trehalose-6-phosphate synthase，Put TPS）的部分序列。通過(guò)3′End c DNA amplification方法獲得基因缺失的3′序列［26］。所需引物如下：QT：5′-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，QO：5′-CCAGTGAGCAGAGTGACG-3′，QI：5′-GAGGACTCGAGCTCAAGC-3′，TPS-RACE1：5′-ATGACCTCTTCGAGGGCTTTCGG-3′，TPSRACE2：5′-ATGACCTCTTCGAGGGCTTTCGG-3′。

經(jīng)比對(duì)拼接后，克隆全長(zhǎng)序列。Put TPS基因全長(zhǎng)克隆引物如下：TPS-F：5′-TTTCCTCGCCTTGGACTCGC-3′，TPS-R：5′-CTGGATGAGCCGCACGATGT-3′。ORF founder（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／gorf／gorf．html）程序確定其開(kāi)放讀碼框。ProtParam（http：／／au．expasy．org／tools／protparam．html）軟件計(jì)算推導(dǎo)的蛋白質(zhì)的分子量及理論等電點(diǎn)；利用http：／／www．cbs．dtu．dk／services／TMHMM-2．0／對(duì)該基因的跨膜結(jié)構(gòu)分析；利用Blast P（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST／）進(jìn)行序列同源性搜索；利用Clustal X 1．83軟件對(duì)具有同源性、不同植物來(lái)源的TPS蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并繪制分子進(jìn)化樹(shù)。

1．3 m RNA表達(dá)特性分析

液氮速凍研磨收集的樣品，用TRIzol一步法提取總RNA，以10μg RNA在1．0%的甲醛瓊脂糖變性凝膠上電泳，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。以DIG標(biāo)記的Put TPS c DNA為探針進(jìn)行雜交，并利用CDP-Star TM（Roche）來(lái)檢測(cè)Northern雜交信號(hào)［27］。

1．4 過(guò)表達(dá)Put TPS酵母菌株的抗逆性分析

分別取起始OD600約為0．6的p YES2-Put TPS和載體p YES2的10－1，10－2，10－3，10－4和10－5的酵母菌液于1．0和1．2 mol／L NaCl、14和25 mol／L Na HCO3、3．0 mol／L H2O2、1．8 mol／L Sorbital的半乳糖誘導(dǎo)的酵母培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3～5 d，調(diào)查其生長(zhǎng)狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2．1 Put TPS基因的克隆與序列分析

通過(guò)對(duì)堿茅酵母文庫(kù)的耐鹽堿性篩選，從中均分離得到一抗性酵母克隆，通用引物PCR產(chǎn)物插入T載體測(cè)序得長(zhǎng)度為1153 bp的堿茅6-磷酸海藻糖合成酶基因片斷，測(cè)序后進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)具有該基因片段5′端的完整序列。該基因片段的堿基序列與紅豆杉（Festuca mairei，JN415683．1）、玉米（Zea mays，GU228588．1 76）的同源性分別為90%，76%。初步確認(rèn)該基因片段為堿茅TPS基因序列的一部分（圖1）。根據(jù)這一段序列設(shè)計(jì)特異性引物TPS-RACE1、TPS-RACE2，分別與3′端通用引物QO、QI配對(duì)，擴(kuò)增分離出長(zhǎng)為2500 bp的端片段，測(cè)序比對(duì)后與中間片段序列一起拼接得到長(zhǎng)3400 bp的Put TPS基因的cDNA全長(zhǎng)序列，重新克隆基因并測(cè)序，Put TPS基因全長(zhǎng)3358 bp。序列的ORF finder分析證實(shí)該基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)2646 bp，推定編碼882個(gè)氨基酸，其中5′端非翻譯區(qū)包括612 bp，3′端非翻譯區(qū)包括100 bp，3359～3386位為Poly（A）尾（圖1）。BLASTP對(duì)Put TPS蛋白保守區(qū)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明該蛋白屬于TPS蛋白（圖2）。GenBank中選取部分植物的TPS蛋白，經(jīng)BLASTX分析發(fā)現(xiàn)堿茅TPS蛋白與水稻（Oryza sativa Japonica Group，AAN52740．1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，CAB10557．1）、玉米（Zea mays，ADA67991．1）、陸地棉（Gossypium hirsutum，AAV65494．1）、甜瓜（Cucumis melo subsp．melo，ADN34028．1）、紅豆杉（Festuca mairei，AEO13239．1）、銀杏（Ginkgo biloba，AAX16014．1）、丹參（Salvia miltiorrhiza，AEQ54916．1）、甘藍(lán)（Brassica oleracea，ABD 65165．1）、蓖麻（Ricinus communis，XP-002522255．1）等高等植物的TPS蛋白具有較高同源性，同源性高達(dá)60%～90%（圖3）。軟件Clustalw1．8．1對(duì)此種蛋白相近的10個(gè)物種的TPS蛋白序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，堿茅中克隆的TPS蛋白與羊草（Leymus chinensis）的TPS蛋白親緣關(guān)系最近，與黃瓜、蓖麻中發(fā)現(xiàn)的TPS蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4）。

ProtParam預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白質(zhì)的分子量為100．37 k Da，理論等電點(diǎn)（pI）為9．25，為堿性蛋白。負(fù)電荷氨基酸（Asp＋Glu）總數(shù)為95，正電荷氨基酸（Arg＋Lys）總數(shù)為119。不穩(wěn)定系數(shù)為56．06，為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。據(jù)TMHMM v．2預(yù)測(cè)，信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明該基因編碼的蛋白無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。Put TPS編碼的蛋白為一種非跨膜蛋白，這一特性與其他植物中發(fā)現(xiàn)的TPS蛋白相一致。

2．2 Put TPS基因在堿茅不同組織中的表達(dá)

利用Northern blot技術(shù)，對(duì)Put TPS基因在野外生存堿茅的根、莖、葉、花、種子中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，Put TPS基因在莖中未見(jiàn)表達(dá)，在根、葉、花、種子中均有表達(dá)，其中在根和花中表達(dá)水平最高，表明Put TPS基因具有組織表達(dá)特異性（圖5）。

2．3 鹽、堿逆境脅迫下Put TPS基因的m RNA水平表達(dá)特性

為了研究Put TPS基因與鹽、堿脅迫的應(yīng)答相關(guān)性，利用Northern blot技術(shù)分析其m RNA在鹽、堿脅迫下地上組織和地下組織表達(dá)特性的變化（圖6）。在NaCl脅迫處理下，該基因在葉部的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大。在根部，隨著鹽處理時(shí)間的改變，基因的表達(dá)量先降低，但12 h時(shí)表達(dá)量迅速升高，達(dá)到最大，隨后逐漸降低。在Na HCO3脅迫處理下，該基因在葉部的表達(dá)量在6 h時(shí)已達(dá)到最大，根部在12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大。綜上所述，在NaCl、Na HCO3處理下Put TPS基因無(wú)論在根部，還是葉部，都主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)。這表明Put-TPS基因有可能參與了堿茅的耐鹽、堿應(yīng)答反應(yīng)，屬于鹽、堿逆境脅迫的相關(guān)基因。

2．4 p YES2-Put TPS在酵母中的表達(dá)及其抗逆性

酵母是單細(xì)胞真核生物并與植物有著類似的代謝途徑，遺傳操作簡(jiǎn)單易行，是外源蛋白表達(dá)的合適宿主，p YES2是半乳糖誘導(dǎo)的過(guò)表達(dá)載體。因此，本研究利用酵母表達(dá)體系開(kāi)展了轉(zhuǎn)基因酵母對(duì)逆境的耐性實(shí)驗(yàn)。對(duì)含有p YES2-Put TPS和p YES2的酵母菌（陰性對(duì)照）逆境處理的抗性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（圖7），正常情況下，含p YES2-Put TPS和p YES2的酵母菌在無(wú)逆境處理的YPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況相似；但在1 mol／L NaCl脅迫下轉(zhuǎn)p YES2-Put TPS酵母長(zhǎng)勢(shì)略優(yōu)于對(duì)照菌株；隨著NaCl濃度的增加，抗性生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)力成為明顯，當(dāng)濃度達(dá)到1．2 mol／L時(shí)，對(duì)照菌株無(wú)法正常生長(zhǎng)，但轉(zhuǎn)p YES2-Put TPS酵母菌株仍可正常生長(zhǎng)。說(shuō)明過(guò)表達(dá)Put TPS提高了酵母菌株對(duì)鹽脅迫的耐性存活能力。在堿逆境（14和25 mmol／L Na HCO3）、氧化逆境（3．0 mmol／L H2O2）、滲透脅迫（1．8 mol／L Sorbital）等逆境下，轉(zhuǎn)p YES2-Put TPS酵母菌的長(zhǎng)勢(shì)均明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)對(duì)照菌株，這些結(jié)果均說(shuō)明Put TPS在酵母中過(guò)量表達(dá)能夠提高其對(duì)堿、氧化、滲透逆境的耐性。綜上所述，Put TPS基因的過(guò)量表達(dá)對(duì)酵母在環(huán)境脅迫中的生長(zhǎng)發(fā)揮重要作用。

3 討論

我國(guó)因土地鹽堿化、荒漠化，造成劣質(zhì)土地已成為制約區(qū)域可持續(xù)發(fā)展及綠化生態(tài)環(huán)境的核心因素。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了形形色色的植物，包括有著微妙的適應(yīng)環(huán)境的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制，不同的物種針對(duì)相應(yīng)環(huán)境因子的調(diào)控作用卻有著時(shí)空差異的分子基礎(chǔ)［28-30］。

分子選育是抗鹽堿植物新品種的關(guān)鍵，就是從鹽生植物里分離抗鹽堿功能基因。堿茅不僅是一種優(yōu)良的牧草，還是一種寶貴的鹽生種質(zhì)資源，堿茅可在p H 10以上的堿斑地上正常生長(zhǎng)發(fā)育，目前它被人們稱作極端耐鹽堿先鋒植物，種植堿茅不但對(duì)鹽堿土壤具有改良作用，同時(shí)為相關(guān)研究提供了豐富的耐鹽堿基因資源。這不僅有助于培育耐鹽堿轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物、牧草和花卉，而且還為我國(guó)鹽堿草甸草原的改良和綜合治理提供理論基礎(chǔ)，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效應(yīng)。

當(dāng)植物遭遇干旱、鹽堿、低溫等逆境時(shí)，就會(huì)在體內(nèi)積累各種小分子物質(zhì)，提高細(xì)胞液濃度，降低其滲透勢(shì)，并保持一定的壓力勢(shì)，來(lái)維持細(xì)胞的正常膨壓。參與滲透調(diào)節(jié)的物質(zhì)有很多，大致可分為兩大類。一類是由外界進(jìn)入細(xì)胞的無(wú)機(jī)離子，一類是在細(xì)胞內(nèi)合成的有機(jī)物質(zhì)，如脯氨酸、甜菜堿、甘露醇和海藻糖等。研究表明，海藻糖是一種典型的應(yīng)激代謝產(chǎn)物；當(dāng)生物體生長(zhǎng)環(huán)境良好時(shí)，體內(nèi)不積累海藻糖；而當(dāng)生物體處于脅迫環(huán)境（如饑餓、干燥、高溫和高鹽堿等）時(shí)，體內(nèi)就會(huì)迅速積累海藻糖，海藻糖的積累提高了對(duì)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)、酶與細(xì)胞膜等活性物質(zhì)的保護(hù)，而且這些海藻糖會(huì)隨著不良環(huán)境的解除而被降解［30-31］。

植物TPS基因，是海藻糖合成過(guò)程中的關(guān)鍵基因，TPS外源基因的導(dǎo)入，即可合成6-磷酸海藻糖。而6-磷酸海藻糖脫磷酸轉(zhuǎn)化為海藻糖，可由細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的非特異性磷酸酯酶催化完成，所以TPS酶對(duì)海藻糖的積累至關(guān)重要［10，16］。本研究過(guò)表達(dá)Put TPS的酵母對(duì)鹽、堿、氧化及滲透脅迫等多重逆境生長(zhǎng)存活能力均有提高，推定過(guò)表達(dá)Put TPS基因有助于堿茅體內(nèi)海藻糖合成增加，它的積累提高堿茅對(duì)各種逆境脅迫抵御。2003年Jang等［32］在研究轉(zhuǎn)基因水稻Ubi 1：：TPSP（轉(zhuǎn)入TPS和TPP具有雙融合功能基因的轉(zhuǎn)基因水稻）時(shí)發(fā)現(xiàn)，在逆境脅迫下，轉(zhuǎn)Ubi 1：：TPSP基因水稻由于植株體內(nèi)海藻糖的大量積累，提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱、鹽、低溫的耐受性。我們的m RNA轉(zhuǎn)錄研究表明Put TPS受逆境脅迫誘導(dǎo)，這可能也與逆境脅迫下植株體內(nèi)海藻糖合成需要大量的酶積累有至關(guān)重要的關(guān)系。該基因是在極端耐鹽堿植物堿茅中分離得到，這也進(jìn)一步為解釋堿茅為何能更好地適應(yīng)極端惡劣條件的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。以后研究可以考慮在轉(zhuǎn)基因植物上研究該基因的特性，以期揭示Put TPS基因提高生物抗逆性的機(jī)理。這將為深入了解該基因家族的功能提供新的資料，同時(shí)也為進(jìn)一步研究鹽生植物的抗鹽分子機(jī)制鑒定基礎(chǔ)，對(duì)植物抗逆分子育種工作具有一定的理論指導(dǎo)意義。

Reference：

［1］ Elbein A D，Pan Y T，Pastuszak I，et al．New insights on trehalose：a multifunctional molecule．Glycobiology，2003，13（4）：17-27．

［2］ Alvarez-Peral F J，Zaragoza O，Pedreno Y，et al．Protective role of trehalose during severe oxidative stress caused by hydrogen peroxide and the adaptive oxidative stress response in Candida albicans．Microbiology，2002，148（8）：2599-2606．

［3］ Crowe J H，Crowe L M，Chapman D．Preservation of membranes in anhydrobiotic organisms：the role of trehalose．Science，1984，223（4637）：701-703．

［4］ De Virgilio C，Hottiger T，Dominguez J，et al．The role of trehalose synthesis for the acquisition of thermotolerance in yeast．I．Genetic evidence that trehalose is a thermoprotectant．European Journal of Biochemistry／FEBS，1994，219（1-2）：179-186．

［5］ Garcia A B，Engler J，Iyer S，et al．Effects of osmoprotectants upon NaCl stress in rice．Plant Physiology，1997，115（1）：159-169．

［6］ Lillie S H，Pringle J R．Reserve carbohydrate metabolism in Saccharomyces cerevisiae：responses to nutrient limitation．Journal of Bacteriology，1980，143（3）：1384-1394．

［7］ Giaever H M，Styrvold O B，Kaasen I，et al．Biochemical and genetic characterization of osmoregulatory trehalose synthesis in Escherichia coli．Journal of Bacteriology，1988，170（6）：2841-2849．

［8］ Reinders A，Burckert N，Hohmann Surcker T N，et al．Structural analysis of the subunits of the trehalose-6-phosphate synthase／phosphatase complex in Saccharomyces cerevisiae and their function during heat shock．Molecular Microbiology，1997，24（4）：687-695．

［9］ Siebers B，Tjaden B，Michalke K，et al．Reconstruction of the central carbohydrate metabolism of Thermoproteus tenax by use of genomic and biochemical data．Journal of Bacteriology，2004，186（7）：2179-2194．

［10］ Blazquez M A，Santos E，F(xiàn)lores C L，et al．Isolation and molecular characterization of the Arabidopsis TPS1 gene，encoding trehalose-6-phosphate synthase．The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，1998，13（5）：685-689．

［11］ Vogel G，Aeschbacher R A，Muller J，et al．Trehalose-6-phosphate phosphatases from Arabidopsis thaliana：identification by functional complementation of the yeast tps2 mutant．The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，1998，13（5）：673-683．

［12］ Kosmas S A，Argyrokastritis A，Loukas M G，et al．Isolation and characterization of drought-related trehalose 6-phosphate-synthase gene from cultivated cotton（Gossypium hirsutum L．）．Planta，2006，223（2）：329-339．

［13］ Pramanik M H，Imai R．Functional identification of a trehalose 6-phosphate phosphatase gene that is involved in transient induction of trehalose biosynthesis during chilling stress in rice．Plant Molecular Biology，2005，58（6）：751-762．

［14］ Shima S，Matsui H，Tahara S，et al．Biochemical characterization of rice trehalose-6-phosphate phosphatases supports distinctive functions of these plant enzymes．The FEBS Journal，2007，274（5）：1192-1201．

［15］ Wang Y J，Hao Y J，Zhang Z G，et al．Isolation of trehalose-6-phosphate phosphatase gene from tobacco and its functional analysis in yeast cells．Journal of Plant Physiology，2005，162（2）：215-223．

［16］ Zentella R，Mascorro-Gallardo J O，Van Dijck P，et al．A Selaginella lepidophylla trehalose-6-phosphate synthase complements growth and stress-tolerance defects in a yeast tps1 mutant．Plant Physiology，1999，119（4）：1473-1482．

［17］ Leyman B，Van Dijck P，Thevelein J M．An unexpected plethora of trehalose biosynthesis genes in Arabidopsisthaliana．Trends in Plant Science，2001，6（11）：510-513．

［18］ Xie X，Kirby J，Keasling J D．Functional characterization of four sesquiterpene synthases from Ricinus communis（castor bean）．Phytochemistry，2012，78：20-28．

［19］ Zang B，Li H，Li W，et al．Analysis of trehalose-6-phosphate synthase（TPS）gene family suggests the formation of TPS complexes in rice．Plant Molecular Biology，2011，76（6）：507-522．

［20］ Zhuang X，Kollner T G，Zhao N，et al．Dynamic evolution of herbivore-induced sesquiterpene biosynthesis in sorghum and related grass crops．The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，2012，69（1）：70-80．

［21］ Vandesteene L，Ramon M，Le Roy K，et al．A single active trehalose-6-P synthase（TPS）and a family of putative regulatory TPS-like proteins in Arabidopsis．Molecular Plant，2010，3（2）：406-419．

［22］ Li H W，Zang B S，Deng X W，et al．Overexpression of the trehalose-6-phosphate synthase gene Os TPS1 enhances abiotic stress tolerance in rice．Planta，2011，234（5）：1007-1018．

［23］ Avonce N，Leyman B，Mascorro-Gallardo J O，et al．The Arabidopsis trehalose-6-P synthase At TPS1 gene is a regulator of glucose，abscisic acid，and stress signaling．Plant Physiology，2004，136（3）：3649-3659．

［24］ Peng Y H，Zhu Y F，Mao Y Q，et al．Alkali grass resists salt stress through high［K＋］and an endodermis barrier to Na＋．Journal of Experimental Botany，2004，55（398）：939-949．

［25］ Sambrook J R，David W．Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3rd ed［M］．Cold Spring Harbor，N．Y．：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001．

［26］ Scotto-Lavino E，Du G，F(xiàn)rohman M A．Scotto-lavino EDu GFrohman M A 3′end cDNA amplification using classic RACE．Nature Protocols，2006，1（6）：2742-2745．

［27］ Reshkin S J，Cassano G，Womersley C，et al．Preservation of glucose transport and enzyme activity in fish intestinal brush border and basolateral membrane vesicles．Journal of Experimental Biology，1988，140：123-135．

［28］ Kong L F，Zhang J Y，Liu Z P，et al．Cloning of a S-adenosyl methionine synthetase gene from Cleistogenessongorica and its expression under drought stress．Acta Prataculturae Sinica，2013，22（1）：268-275．

［29］ Ma Y，Guo L Q，Zhang S F，et al．Solute accumulation and distribution traits of an alkali resistant forage plant kochia sieversiana and physiological contribution of organic acid under salt and alkali stresses．Acta Prataculturae Sinica，2013，22（1）：193-200．

［30］ Li X Y，Lin J X，Li X J，et al．Growth adaptation and Na＋and K＋metabolism responses of Leymus chinensis seedlings under salt and alkali stresses．Acta Prataculturae Sinica，2013，22（1）：201-209．

［31］ Vanlaere A．Trehalose，reserve and／or stress metabolite．FEMS Microbiol Lett，1989，63（3）：201-210．

［32］ Jang I C，Oh S J，Seo J S，et al．Expression of a bifunctional fusion of the escherichia coli genes for trehalose-6-phosphate synthase and trehalose-6-phosphate phosphatase in transgenic rice plants increases trehalose accumulation and abiotic stress tolerance without stunting growth．Plant Physiology，2003，131（2）：516-524．

［28］ 孔令芳，張吉宇，劉志鵬，等．無(wú)芒隱子草SAMS1基因的克隆及干旱脅迫下的表達(dá)分析．草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22（1）：268-275．

［29］ 麻瑩，郭立泉，張淑芳，等．鹽堿脅迫下抗堿牧草堿地膚溶質(zhì)積累、分布特點(diǎn)及有機(jī)酸的生理貢獻(xiàn)．草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22（1）：193-200．

［30］ 李曉宇，藺吉祥，李秀軍，等．羊草苗期對(duì)鹽堿脅迫的生長(zhǎng)適應(yīng)及Na＋、K＋代謝響應(yīng)．草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22（1）：201-209．

Cloning of a TPS gene and analysis of its function in stress tolerance in Puccinellia tenuiflora

LI Ying1，2，LIU Shenkui1*
1.Alkali Soil Natural Environmental Science Center，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.Key Laboratory of Crop Germplasm Improvement and Cultivation in Cold Regions，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China

In this study，a 6-trehalose phosphate synthase gene（TPS）fragment，1153 bp in length，was isolated through NaCl and Na HCO3screening from Puccinellia tenuiflora yeast cDNA library．A 3′-end cDNA amplification technique was used to clone Put TPS．The full-length c DNA is 3358 bp containing an open reading frame（ORF）of 882 amino acids．Multiple alignment analysis based on amino acids of TPS proteins of rice，Arabidopsis，maize，and other higher plants revealed that the amino acid homologies were about 60%to 90%．The tissue expression patterns of P.tenuiflora Put TPS and the expression under NaCl and Na HCO3stress were further investigated by northern blot．Also the recombinant yeast INVScI（p YES2-Put TPS）and control INVScI（p YES2）were subjected to salt，drought，osmotic and oxidative stresses．Put TPS was highly expressed in roots and flowers；in roots and leaves，NaCl and Na HCO3induced up-regulated expression of Put-TPS genes and the recombinant yeast cells showed higher stress resistance than control cells．It was also found that the TPS from alkali grass contributes to salt，drought，osmotic and oxidative resistance．The present study indicated that there was a relationship between Put TPS expression and multiple stresses，and Put TPS may play an important role for P.tenuiflora during adaption to environmental abiotic stress．

Puccinellia tenuiflora；6-trehalose phosphate synthase；gene expression；yeast

10．11686／cyxb20150113 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

李瑩，柳參奎．堿茅6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析．草業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24（1）：99-106．

Li Y，Liu S K．Cloning of a TPS gene and analysis of its function in stress tolerance in Puccinellia tenuiflora．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（1）：99-106．

2013-12-13；改回日期：2014-01-15

黑龍江省寒地作物種質(zhì)改良與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)開(kāi)放課題資助項(xiàng)目（CGIC201204），教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃（IRT13053），黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C201406），中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（2572014BA20），863項(xiàng)目（2013AA102701-7）和哈爾濱市自然科學(xué)基金（2008RFQXN007）資助。

李瑩（1979-），女，黑龍江哈爾濱人，講師，博士。E-mail：LY7966＠163．com

*通訊作者Corresponding author．E-mail：shenkuiliu＠nefu．edu．cn