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      標準化無菌及支原體檢驗培養(yǎng)基應用試驗

      2015-02-23 04:33:25李倩
      畜牧獸醫(yī)科技信息 2015年7期
      關鍵詞:無菌支原體培養(yǎng)基

      李倩

      (哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司,黑龍江 哈爾濱 150069)

      標準化無菌及支原體檢驗培養(yǎng)基應用試驗

      李倩

      (哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司,黑龍江 哈爾濱 150069)

      經靈敏度檢查合格的標準化無菌及支原體檢驗培養(yǎng)基已經在4個生物制藥公司進行應用實驗并且投入使用,分批進行抗原檢測,99.5%的培養(yǎng)基經試驗檢測未被污染,可以投入使用。本文圍繞這種無菌及支原體檢驗培養(yǎng)基進行研究分析,從材料和方法入手,最終進行檢測實驗以及方法探討。

      無菌;支原體檢驗;培養(yǎng)基

      支原體是一種常見于生物制品中的污染微生物,它的污染不像細菌或者真菌那樣容易被肉眼看見,所以在其培養(yǎng)時也很難被觀察,這樣就需要我們配置適宜的培養(yǎng)基。支原體對生長條件的要求比較嚴格,比如對營養(yǎng)條件的要求,對溫度,濕度,pH的要求。由于這個原因,支原體的檢驗培養(yǎng)基一直是從事此方面工作人員難以解決的問題,下面我們就一起來分析研究本實驗的培養(yǎng)基檢驗試驗,具體情況如下:

      1 材料

      葡萄糖,乳蛋白水解物,25%酵母浸出物,1%L-半膚氨酸10.0mL,10%精氨酸,血清(本實驗室采集),NaCl,KCl等鹽,PPLO肉湯粉等;本實驗用的所有類型的水都是北京某生物制藥廠生產的,都是經過國家藥品檢測而達到標準的水質,其他實驗材料也都是經過有關部門質量檢測的。而本實驗的支原體檢驗培養(yǎng)基在制備時,完全按照國家制定標準完成,有質量的保障。

      2 方法

      2.1培養(yǎng)基的制備無菌檢驗培養(yǎng)基:需要用到的材料有硫乙醇酸鹽、酪陳瓊脂和葡萄糖蛋白陳干粉。對這些材料進行簡單的處理。將這三種材料的培養(yǎng)基分別按照9mL/支,6mL/支,7mL/支進行封裝,之后采用高溫高壓法進行滅菌,控制適當?shù)臅r間,準備為后期試驗所用。

      支原體檢驗培養(yǎng)基:主要原料有:一定量的PPLO肉湯粉和葡萄糖,25%酵母浸出液100.0mL,10%精氨酸20.0mL,10倍濃縮MEM溶液10.0mL,血清,青霉素(8萬IU/mL)10.0mL蒸餾水。配制后調節(jié)培養(yǎng)基pH,使之維持弱堿性,采用適宜的方法去除雜菌的污染,然后在-20℃條件下進行保存。所用的固體培養(yǎng)基就是在此基礎上加入適量的瓊脂,使培養(yǎng)基呈現(xiàn)固態(tài),但培養(yǎng)基的成分及含量基本保持不變。

      2.2支原體檢驗培養(yǎng)基的應用試驗培養(yǎng)基的配制的成功與否要看培養(yǎng)基培養(yǎng)支原體的情況以及支原體生長的情況。本實驗選用豬鼻支原體(BTS-7)進行試驗,試驗的方法為:將培養(yǎng)基依次稀釋10倍到10-3,10-4,10-5,一直依次遞減,再將支原體加入其中,將其置于適宜溫度下培養(yǎng)4~5d,當其中一組試驗的培養(yǎng)基的顏色出現(xiàn)明顯變化時停止試驗,即為試驗終點,記錄實驗數(shù)據(jù),進行后期分析。

      2.3培養(yǎng)基的保存試驗用控制變量的方法,對培養(yǎng)基進行保存的檢測試驗。先取5支試管,分別加入等量且適宜的培養(yǎng)基,放入-20℃恒溫箱中保存,記為第1組;再取5支試管,加入與第1組等量的培養(yǎng)基,放入37℃的恒溫箱里保存,記為第2組。將兩組的五支試管分別保存1d,2d,3d,4d,5d。前兩組在保存規(guī)定時間后,將培養(yǎng)基與室溫溫度相同時,直接進行上述檢測試驗。而我們設置的第3組實驗則是將相同量的5支試管的培養(yǎng)基先進行-20℃保存0.5d,1d,1.5d,2臺,2.5d,再保存在37℃下相應的天數(shù),進行這種冰凍-融化處理,在進行檢測,記錄試驗的結果。

      3 結果

      從支原體檢驗培養(yǎng)基的試驗中可以看出,這種配置方法的培養(yǎng)基濃度對于支原體培養(yǎng)的影響不大,先出現(xiàn)顏色變化的培養(yǎng)基也是隨機的,而對所有參加檢測的抗原,非禽源支原體檢驗培養(yǎng)基抽檢樣品,其中包括疫苗,細胞培養(yǎng)上清液等,血清支原體檢驗培養(yǎng)基抽檢血清樣品,他們在無菌培養(yǎng)基檢測的結果一致。均沒有污染情況產生。而經過培養(yǎng)基的保存試驗可以得出結論,從支原體的生長速度可以看出,培養(yǎng)基在低溫和適度高溫,以至緩凍的條件下都可以保持較高的穩(wěn)定性,支原體活菌滴度平均達到109/mL,營養(yǎng)條件保持良好,pH值沒有明顯變化,各個微量元素的含量無明顯變化,且批次之間沒有差異。

      4 討論

      將培養(yǎng)基進行一定的改良,可以確保培養(yǎng)基的質量,提高檢驗工作的效率。由于支原體檢驗培養(yǎng)基對于培養(yǎng)條件要求特別嚴格,所以在配制時應注意改良方法。影響其質量的條件因素有很多,通常情況下一般的影響因素有溫度,濕度以及培養(yǎng)時氧氣的濃度。溫度主要能夠影響支原體的存活狀況,溫度過高將使支原體無法正常正常生存繁殖,溫度過低則又會使支原體處于休眠狀態(tài),所以控制培養(yǎng)時的溫度是十分重要的。濕度對支原體培養(yǎng)的影響也是較為顯著的,濕度強度會直接影響到支原體的生長。培養(yǎng)過程中氧氣濃度不僅會影響支原體的生長速度,還可能有助于其他的雜菌生長,導致支原體的培養(yǎng)失敗。在支原體的培養(yǎng)過程中要對培養(yǎng)的溫度、濕度及氧氣濃度都要進行嚴格的控制,只要這樣才能進一步保證支原體培養(yǎng)的成功。

      5 結語

      本文對標準化無菌及支原體檢驗培養(yǎng)基應用試驗進行分析研究,改進了支原體檢驗培養(yǎng)基的配制,使它的更易保存,不易被污染。長期以來支原體培養(yǎng)檢驗的培養(yǎng)基的原料質量一直沒有統(tǒng)一的標準,但通過大量的試驗研究總結了對于配制培養(yǎng)基的配制更有利的各原材料的質量參數(shù)配比。避免了因培養(yǎng)基質量而帶來的各種實驗誤差,提高了支原體檢驗工作的準確性。而且試驗中對于培養(yǎng)基保存條件的實驗更是進行了深入研究,模擬了各種情況下的保存,這為支原體檢驗培養(yǎng)基的儲存和運輸起到了很好的作用。

      [1]張瑞婷,等.獸用生物制品的支原體污染檢驗及注意事項[J].中國獸藥雜志2012,35(2):28-30.

      [2]羅玉峰,等,標準化無菌及支原體檢驗培養(yǎng)基應用試驗[J].中國獸藥雜志,2012,43(6):26-29.

      [3]羅玉峰,等.獸用藥品無菌檢驗用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基的研究[J].中國獸藥雜志,2011,43(4):28-29.

      10.3969/J.ISSN.1671-6027.2015.07.017

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