盧朝成，符華林，范巧佳，張 偉，舒 剛，周 濤，張艷麗，劉夢嬌

(四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安 625014)

響應面法優(yōu)化促孕灌注液中總黃酮的提取工藝

盧朝成，符華林，范巧佳，張 偉，舒 剛，周 濤，張艷麗，劉夢嬌

(四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安 625014)

【目的】 采用響應面法優(yōu)化促孕灌注液中總黃酮的提取工藝，為促孕灌注液總黃酮的實際生產提供參考。【方法】 采用水煎醇沉法制備促孕灌注液，以總黃酮得率為指標，在單因素試驗的基礎上，采用響應面的中心組合設計，考察液(mL)料(g)比(下同)、煎煮時間、提取次數(shù)3個因素對促孕灌注液中總黃酮得率的影響，對總黃酮的提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化分析?！窘Y果】 單因素試驗結果表明，最佳浸泡時間為10 min，液料比為15∶1，煎煮時間為30 min，提取次數(shù)為3次。選擇對總黃酮得率影響明顯的液料比、煎煮時間、提取次數(shù)3個因素進行響應面優(yōu)化分析試驗，得到總黃酮最優(yōu)提取條件為：液料比17.5∶1，煎煮38 min，提取3次。在最優(yōu)提取工藝條件下，促孕灌注液總黃酮的理論得率為14.082 mg/g，實測得率為14.193 mg/g，二者誤差較小?！窘Y論】 優(yōu)化得到了促孕灌注液中總黃酮提取工藝，該工藝穩(wěn)定、重復性好、總黃酮得率高。

促孕灌注液；總黃酮；提取工藝；響應面優(yōu)化；水煎醇沉法

促孕灌注液為《中國獸藥典》(2010年版第2部)收錄的成方制劑，由淫羊藿、紅花和益母草3味中藥通過水煎醇沉法制備而成，是防治母畜卵巢靜止和持久黃體不孕癥的中藥成方制劑。經臨床證明，該制劑治療效果確切、治愈率高、不良反應小、耐藥率低，因而受到越來越多的關注[1-2]。黃酮是促孕灌注液中的主要成分，有激素樣作用[3-5]。有研究表明，促孕灌注液中的黃酮有促進子宮生長和卵巢排卵的作用[6-7]。

目前對促孕灌注液的研究較多[2,7]，也已有不同提取工藝的研究報道[8-9]。如周淑貞等[10]考察了不同提取方法對促孕灌注液中有效成分含量的影響，認為半仿生醇沉法能夠提高有效成分的含量。水煎醇沉法是《中國獸藥典》中促孕灌注液的法定提取方法，但這種方法對促孕灌注液總黃酮的提取效率如何尚未見研究報道。本研究采用紫外分光光度法測定促孕灌注液中的總黃酮含量，利用單因素試驗分析水煎醇沉法提取促孕灌注液中黃酮類化合物的主要影響因素，并采用響應面法[11-12]優(yōu)化提取工藝，以期得到促孕灌注液總黃酮的最優(yōu)提取條件，進而為其實際生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀 器

UV-2102P型分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；RE-2000型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；電子天平，沈陽龍騰電子有限公司。

1.2 材 料

淫羊藿，四川洪雅縣瓦屋山藥業(yè)有限公司，批號：120401；紅花，四川御鼎堂中藥飲片有限公司，批號：465120901；益母草，四川洪雅縣瓦屋山藥業(yè)有限公司，批號：120601；以上藥材經四川農業(yè)大學范巧佳副教授鑒定均為正品藥材。蘆丁標準品，中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-200707；無水三氯化鋁，天津市福晨化學試劑廠，批號：20121102。其他試劑均為分析純。

1.3 總黃酮測定方法的建立

采用紫外分光光度法測定促孕灌注液中的總黃酮。精密稱定蘆丁標準品10.0 mg，置50 mL容量瓶中，加體積分數(shù)60%乙醇適量，水浴微熱溶解，放冷至室溫，用體積分數(shù)60%乙醇定容，配制成質量濃度為200 μg/mL的蘆丁母液。吸取蘆丁母液1.25，1.50，1.75，2.00，2.25，2.50，2.75 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加l mol/L三氯化鋁溶液1.00 mL，再加體積分數(shù)60%乙醇至刻度，搖勻，使蘆丁標準液最終質量濃度分別為10，12，14，16，18，20和22 μg/mL，以不加蘆丁母液的溶液為空白對照，于415 nm處測定吸光度，以蘆丁質量濃度為橫坐標(x)、吸光度為縱坐標(y)進行回歸分析，得到標準曲線回歸方程。

1.4 供試品中總黃酮的測定

精密吸取制備的促孕灌注液供試品100 μL置于10 mL容量瓶中，用體積分數(shù)60%乙醇定容，搖勻；取1 mL樣品于10 mL容量瓶中，加入1 mol/L三氯化鋁溶液1 mL，加體積分數(shù)60%乙醇溶液至刻度，搖勻，以不加樣品的溶液為空白對照，于415 nm處測定吸光度，將其代入標準曲線方程，計算總黃酮的質量濃度，并按以下公式計算提取物中總黃酮的得率(Y，mg/g)：

式中：c為供試品溶液中總黃酮的質量濃度，μg/mL,由回歸方程計算；a為測定時提取液的稀釋倍數(shù)；V為提取液的總體積,mL；m為3味藥材的總質量,g。

1.5 促孕灌注液的制備

稱取淫羊藿4.0 g、益母草4.0 g、紅花2.0 g于300 mL燒杯中，加入適量的蒸餾水，浸泡一定時間后，按不同提取次數(shù)和提取時間煮沸提取，紗布過濾，合并提取液，濃縮，放冷，加入一定量的乙醇除去雜質，抽濾，除去濾液中的乙醇，加蒸餾水到10.0 mL，即得促孕灌注液。

1.6 促孕灌注液中總黃酮提取的單因素試驗

按照1.5節(jié)方法，保持其他條件不變，分別考察浸泡時間、液(mL)料(g)比(下同)、煎煮時間和提取次數(shù)對總黃酮得率的影響。

(1)浸泡時間。固定液料比為10∶1，煎煮10 min，提取2次，考察不同浸泡時間(0，10，20，30，40 min)對總黃酮得率的影響。

(2)液料比。固定浸泡時間為10 min，煎煮10 min，提取2次，考察不同液料比(10∶1，12.5∶1，15∶1，17.5∶1，20∶1)對總黃酮得率的影響。

(3)煎煮時間。固定浸泡時間為10 min，液料比為15∶1，提取2次，考察不同煎煮時間(10，20，30，40，50 min)對總黃酮得率的影響。

(4)提取次數(shù)。固定浸泡時間為10 min，液料比為15∶1，煎煮10 min，考察不同提取次數(shù)(1，2，3，4，5次)對總黃酮得率的影響。

1.7 響應面法優(yōu)化促孕灌注液中總黃酮的提取工藝

為了分析各因素之間的交互作用對促孕灌注液中總黃酮得率的影響，以確定最佳的提取工藝，根據Box-Behnken試驗設計原理，運用Design Expert 8.05b設計響應面試驗，在單因素試驗結果的基礎上，分別以液料比、煎煮時間、提取次數(shù)這3個因素進行三因素三水平組合試驗，共計17個試驗組合，試驗因素及水平見表1。每個自變量的低、中、高試驗水平分別以-1、0、1進行編碼，以總黃酮得率為指標確定最佳工藝條件。

2 結果與分析

2.1 總黃酮測定方法的建立

以蘆丁質量濃度為自變量x、吸光度為因變量y進行回歸分析，得到標準曲線回歸方程為：y=0.024 6x+0.017 4，R2=0.999 3，在x=10～22 μg/mL線性關系良好。日內和日間精密度及回收率測算結果(表2)表明，該測定方法穩(wěn)定，重復性高。

2.2 浸泡時間對促孕灌注液中總黃酮得率的影響

如圖1顯示，浸泡時間對促孕灌注液中總黃酮得率的影響不明顯，這可能是由于細胞內的總黃酮等有效成分因細胞壁的影響不易擴散到提取液中所致。但是為了盡量使藥材表面潤濕，為加熱時有效成分的擴散提供條件，浸泡時間以10 min為宜。

2.3 液料比對促孕灌注液中總黃酮得率的影響

圖2結果表明，當液料比達到15∶1之前，隨著液料比的增加，總黃酮得率變化較大。這可能是在一定范圍內，液料比的增加使得提取過程中的濃度差增加，藥物易于從藥材組織中擴散出來[13]；但是隨著液料比的進一步增加，提取液的增加使?jié)饪s時間延長，總黃酮因長時間受熱被破壞，使得其得率未能明顯增加[14]。所以本著節(jié)約資源和控制生產成本的原則，選擇液料比為15∶1。

2.4 煎煮時間對促孕灌注液中總黃酮得率的影響

圖3表明，在煎煮10～50 min時,隨著煎煮時間的延長，促孕灌注液總黃酮得率呈先增加后降低的變化趨勢，其中以煎煮時間為30 min時提取效果最好。這可能是因為隨著煎煮時間的進一步延長，其中的黃酮類物質因長時間受熱而分解[15]所致。

2.5 提取次數(shù)對促孕灌注液中總黃酮得率的影響

由圖4可以看出，提取次數(shù)為1～3次時，隨提取次數(shù)增加，促孕灌注液總黃酮得率持續(xù)增加。提取次數(shù)為4次和5次時，總黃酮得率與提取3次時相比略有下降?？紤]到增加提取次數(shù)可使提取液體積增加，導致濃縮時工作量增加，從而增加生產成本，所以提取次數(shù)以3次為宜。

2.6 促孕灌注液總黃酮提取工藝的響應面法優(yōu)化

由單因素試驗結果可知，浸泡時間對促孕灌注液中總黃酮提取影響不大，因此選取對總黃酮提取影響顯著的液料比(A)、煎煮時間(B)、提取次數(shù)(C)為變量，以總黃酮得率為響應值，進行響應面分析試驗，結果見表3。

利用Design Expert 8.05b軟件對表3試驗數(shù)據進行多元回歸擬合。得到促孕灌注液中總黃酮的得率(Y)對液料比(A)、煎煮時間(B)、提取次數(shù)(C)的二次多項回歸模型為：總黃酮得率(Y,mg/g)=14.11+0.16A+0.27B+0.60C+0.21AB+0.056AC+0.099BC-0.55A2-0.36B2-0.66C2。方程回歸分析及促孕灌注液中總黃酮提取的響應面試驗結果的方差分析結果見表4。

對各項進行F檢驗，P<0.05為顯著項，P<0.01為極顯著項。由表4方差分析結果可知，模型F值為4.957 163，0.01F=0.023 2<0.05，表明該模型顯著，不同處理間差異顯著，說明試驗結果合理，回歸方程在試驗點上與結果擬合較好。模型相關系數(shù)R2=0.864 4，說明此模型與實際試驗擬合較好；試驗失擬項小，說明試驗方法可靠，能夠很好地描述試驗結果，使用該方程代替真實的試驗點進行分析是可行的；其中C、A2、C2項對總黃酮得率的影響顯著，由此可以看出試驗因素對響應值的關系不是簡單的線性關系[16]，二次項也對響應值有很大的影響，根據方程所繪制的響應面圖和等高線圖見圖5～7。

圖5顯示，促孕灌注液總黃酮得率受液料比與煎煮時間交互作用的影響，當液料比一定時，隨著煎煮時間的延長，總黃酮得率先增加達到峰值后又有所減??；當煎煮時間一定時，得率隨著液料比的增加也是先增加后減小。圖6表明，總黃酮得率受液料比與提取次數(shù)交互作用的影響，當液料比(或提取次數(shù))一定時，得率均隨著提取次數(shù)(或液料比)的增加先提高后降低。圖7表明，煎煮時間和提取次數(shù)對總黃酮的得率有交互影響，當煎煮時間一定時，總黃酮得率隨提取次數(shù)的增加先增加后減??；當提取次數(shù)一定時，得率隨著煎煮時間的增加先增加后減小。

2.7 驗證試驗

通過Design Expert 8.05b軟件求解方程，得到促孕灌注液中總黃酮的最佳提取工藝條件為：液料比17.5∶1，煎煮時間37.55 min，提取次數(shù)3.55次，此條件下總黃酮理論得率為14.082 mg/g?？紤]到實際操作的局限性，將上述試驗條件修正為：液料比17.5∶1，煎煮38 min，提取3次。用修正后的試驗條件進行3個重復的驗證試驗，得到總黃酮的平均得率為14.193 mg/g，與預測值基本一致(相對誤差僅為0.78%)，表明該方程對實際情況擬合較好，充分驗證了所建模型的正確性。

3 結 論

本研究以促孕灌注液中的總黃酮得率為評價指標，采用響應面法優(yōu)化實際生產中從促孕灌注液提取總黃酮的工藝條件。最終優(yōu)化得到的提取工藝為：液料比17.5∶1，煎煮時間38 min，提取次數(shù)3次，在該工藝條件下總黃酮的平均得率較高，為 14.193 mg/g。本研究結果為實際生產奠定了基礎。

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Optimization of total flavonoids extraction from Fertility-promoting intrauterine infusion liquid using response surface methodology

LU Chao-cheng,FU Hua-lin,FAN Qiao-jia,ZHANG Wei,SHU Gang, ZHOU Tao,ZHANG Yan-li,LIU Meng-jiao

(CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince,Ya’an,Sichuan625014,China)

【Objective】 This study estimated the optimal conditions for total flavonoids extraction from Fertility-promoting intrauterine infusion liquid based on response surface methodology to provide theoretical foundation for its further processing and utilization.【Method】 The Fertility-promoting intrauterine infusion liquid was prepared by decoction and alcohol precipitation.On the basis of single factor test,response surface methodology was applied to optimize the extraction conditions including water (mL)-feed (g) ratio (the same below),boiling time,and extraction times.【Result】 The optimum soaking time,water-feed ratio,boiling time,and extraction times based on single factor test were 10 min,15∶1,30 min,and 3 times,respectively.The water-feed ratio,boiling time and extraction times that had significant effects on the extraction rate of total flavonoids were selected for response surface optimization test.The optimal water-feed ratio,boiling time,and extraction times were 17.5∶1,38 min,and 3 times,respectively.The predicted extraction rate of 14.082 mg/g was very close to observed rate of 14.193 mg/g.【Conclusion】 The optimized extraction process was stable,reproducible,and had high total flavonids yield from Fertility-promoting intrauterine infusion liquid.

Fertility-promoting intrauterine infusion liquid;total flavonoids;extraction of condition;response surface optimization;decoction and alcohol precipitation

2013-10-22

教育部長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃創(chuàng)新團隊基金項目(IRT0848)；四川農業(yè)大學“優(yōu)秀碩士論文培育基金”項目

盧朝成(1987-)，男，四川龍泉驛人，在讀碩士，主要從事藥物新劑型研究。E-mail:luchaocheng712@sina.com

符華林(1972-)，男，四川華鎣人，副教授，博士，碩士生導師，主要從事藥物新劑型與新制劑研究。 E-mail:fuhl2005@sohu.com

時間:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.022

S853.76;R944.1

A

1671-9387(2015)03-0007-06

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.022.html