熒光定量PCR檢測高致病性豬藍耳病的實踐

雷金虎

（湖南省洞口縣畜牧水產(chǎn)局石江鎮(zhèn)動物防疫站，湖南邵陽 422000）

熒光定量PCR檢測高致病性豬藍耳病的實踐

雷金虎

（湖南省洞口縣畜牧水產(chǎn)局石江鎮(zhèn)動物防疫站，湖南邵陽 422000）

應用PCR方法對湖南省邵陽市10個生豬養(yǎng)殖基地的120份樣品（血液樣品100份，組織病料10份），以及16個規(guī)模豬樣的200份樣品（血液樣品162份，組織病料38份）逐步開展了豬藍耳病檢測，檢測結果為陰性，即表明在豬群中沒有發(fā)生豬健康帶毒以及隱性感染的情況。

熒光定量PCR 高致病性豬藍耳病 檢測 應用

高致病性豬藍耳病是由呼吸與繁殖綜合征病毒變異株所引起的急性高致死性疫病。仔豬發(fā)病率可達100%、患病仔豬死亡率在60%以上，患病母豬流產(chǎn)，對養(yǎng)豬業(yè)危害較大。高致病性豬藍耳病已經(jīng)引起了相關部門及養(yǎng)豬業(yè)從業(yè)者的高度重視，并通過各種手段對其開展了一定的防治。使用PCR熒光方式對該類病癥進行了試驗性的檢測，認真總結檢測經(jīng)驗，希望對同行有所幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

生物安全柜、熒光PCR儀以及高速冷凍離心機。

1.2 試劑

病毒RNA提取盒以及熒光RT-PCR檢測試劑盒。

1.3 實驗材料

來自湖南省邵陽市16個生豬養(yǎng)殖區(qū)域以及20個規(guī)模化豬場的淋巴結、脾等組織以及血液樣品。

1.4 操作方式

1.4.1 樣本處理

對于血液樣品，我們需要將其通過離心機離心2 min，并取100 μl的血清同300 μl混合搖勻。之后，再取0.5 g的組織樣品將其加入pH值為7.2、1.5 ml的PBS，并在研磨之后將其通過離心機離心2 min，取離心完畢100 μl的上清液加入300 μl，變形液混合搖勻。

1.4.2 模板制備

在此環(huán)節(jié)中，我們需要先取一定數(shù)量經(jīng)過DEPC處理完畢的離心管，并向其中加入30μL的處理樣品以及醋酸鈉溶液，經(jīng)過反復顛倒、搖勻之后，將其通過離心機以高速離心15 min，并對搖勻之后的混合液取其上層清液降入300 μl的異丙醇后搖勻，將其放置在液氮中。3 min后，我們則可以將其取出并放在室內(nèi)，在其融化之后再將其通過離心機離心20 min，并在混勻之后向其中加入1 ml量的乙醇，搖勻之后以真空方式將其抽干15 min，最后再向其中加入10 μLRNA酶抑制劑同離子水的混合液，將其放置在零下25℃的環(huán)境中留存后用。

1.5 擴增試劑準備

根據(jù)我們本次試驗所需要的反應管總數(shù)，我們則需要對溶液中所具有的試劑球數(shù)進行計算，并在每一個試劑球上都需要對其施加0.5 μl的taq酶以及30 μl球溶液。而在冰上試劑的溶解方面，我們則需要對其以較輕的力度進行叩擊，使其能夠以充分的方式混勻，并避免出現(xiàn)旋渦振蕩情況。在此過程中，我們也需要對所使用的不同級聯(lián)工具進行細致的計算，并將其中加入經(jīng)過DEPC水處理的1.5 ml溶液到離心管中，在混合充分之后使用離心機對其離心10 s，之后再向其中加入5μl樣本并將其放置到對照管中，且在管蓋封閉之后將其放到熒光PCR儀器中。

2 結果分析

2.1 判定標準

如果經(jīng)過檢測，發(fā)現(xiàn)樣本所具有的Ct值在35以下，且其發(fā)展曲線呈現(xiàn)出一種較為明顯的增長期，我們則可以將其判定為陽性；如果經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)樣本所具有的Ct值在35～40之間，并在重復檢測時檢測值依然處于該區(qū)間內(nèi)、曲線具有較為明顯的增長期，我們也可以將該種情況判定為陽性。而如果我們經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)樣本所具有的Ct值大于40或者根本就檢測不到Ct值，則可以將其判定為陰性。

2.2 敏感性試驗

對于部分一直患有藍耳病、表現(xiàn)為陽性的樣本來說，我們需要通過紫外分光光度法對其濃度進行測試。經(jīng)過初步檢測后，發(fā)現(xiàn)濃度為4.87×109，且在對其進行梯度稀釋10倍后，依然能夠檢測到其濃度為10-7，這也充分顯示出了我們所使用PCR熒光定量方式所具有的較高靈敏度。

2.3 特異性試驗

在設定為空白對照以及非靶 DNA的情況下，我們對PCR熒光方式所具有的特異性進行了檢測，得出檢測結果為陰性。檢測結果如下圖所示：

圖1 特異性試驗

2.4 穩(wěn)定性與重復性試驗

為了能夠對本次試驗所具有的穩(wěn)定性進行試驗，我們分別使用熒光PCR法對相關樣品進行了3次重復性試驗，并得出R2=0.986013，這充分說明了在檢測Ct值小于33的情況下，試驗結果具有較好的線性關系，即對我們所使用的檢測方式穩(wěn)定性進行了驗證。結論如下所示：

圖2 重復性試驗

2.5 樣品檢測

在對熒光檢測方式所具有的穩(wěn)定性以及精確性效果進行驗證之后，我們則以這種熒光PCR的方式對本地區(qū)16個養(yǎng)殖區(qū)域120份樣品以及20個豬場所具有的200樣品進行了檢測，所獲得的結果均為陰性，該檢測結果充分表明了湖南省邵陽市豬群養(yǎng)殖中不存在患有豬藍耳病的健康帶毒以及隱形感染情況。

3 討論

（1）目前，我國對于豬藍耳病的主要診斷方式有酶聯(lián)免疫吸附試驗、間接免疫熒光試驗以及病毒中和試驗等等，但是無論是上述哪一種方式，都具有靈敏度較低、特異性不強以及操作難度大等問題，而對于普通的PCR技術而言，雖然其近年來在技術方面已經(jīng)獲得了較大的提升，但是所具有的檢測精度依然不能夠使人滿意，檢測出假陽性的情況依然存在，且在檢測的過程中很容易伴隨著EB污染物的污染，對于食用者的健康具有較大的安全隱患。而通過TaqMan熒光PCR技術的應用，則因為其所具有的特異性、準確性、敏感性以及快速性等特點使其在我國目前的藍耳病檢測中獲得了較為廣泛的應用。

（2）近年來，高致病性豬藍耳病在我國的很多地區(qū)都出現(xiàn)了較多的患病病例，并對當?shù)氐娜庳i養(yǎng)殖造成了較大的影響。面對此種情況，就需要我們能夠加大原有的地區(qū)病原學監(jiān)測力度，并做好相關的病情預警工作，最大程度避免疫情出現(xiàn)。而在我們通過多種方式做好該類病癥的免疫操作之外，還需要做好豬群的抗體檢測，以此幫助我們對該病癥的抗體發(fā)展規(guī)律進行更好的了解與掌握，進而在對原有免疫程序進行不斷完善的基礎上保障防控效果。

（3）通過我們本次熒光定量PCR檢測豬藍耳病的一系列實驗，可以說已經(jīng)對此種藍耳病的檢測方式以及檢測效果都具有了較好的掌握。而在這個基礎上，我們也需要通過該技術的應用對更多領域，如，豬偽狂犬病、禽流感以及豬瘟等疫病類型進行檢測，以此在不斷使熒光定量PCR檢測方式所具有的檢測領域以及檢測范圍得到擴大的同時，為我國的畜牧業(yè)發(fā)展提供堅實的技術保障。

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