劉思妤，谷　彬，盧新華，王俊杰，譚　斌(湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南郴州　423000)

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瓜蔞皮提取物對高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及機制研究

劉思妤，谷彬，盧新華，王俊杰，譚斌
(湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南郴州423000)

中國圖書分類號: R-284. 1; R322. 123; R329. 25; R587. 2

摘要:目的探討瓜蔞皮提取物(extractive pericarpium trichosanthes，EPT)對體外高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機制。方法體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVECs)，觀察不同濃度瓜蔞皮提取物干預(yù)高糖處理的HUVECs凋亡的變化。MTT法檢測HUVECs的存活率、采用Hoechst染色法檢測細(xì)胞凋亡、采用比色法測定細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活性、Western blot 法以及免疫熒光染色法檢測核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的蛋白表達和p65核移位情況。結(jié)果30 mmol·L－1葡萄糖處理內(nèi)皮細(xì)胞48h能引起細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率及caspase-3的活性明顯增加，細(xì)胞中NF-κB蛋白表達升高及p65核移位增加。用瓜蔞皮提取物(12.5、25、50 mg·L－1)預(yù)處理細(xì)胞1 h，可以增加細(xì)胞活性;降低細(xì)胞凋亡率、caspase-3的活性及NF-κB蛋白表達，呈濃度依賴性，且對高糖誘導(dǎo)的p65核移位有抑制作用。結(jié)論瓜蔞皮提取物對體外高糖誘導(dǎo)的HUVECs凋亡有抑制作用，其作用機制與下調(diào)NF-κB表達和降低caspase-3活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞:瓜蔞皮提取物;高糖;內(nèi)皮細(xì)胞;凋亡; NF-κB; Caspase-3; MTT

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.020.html

譚斌(1968－)，男，教授，研究方向:心血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: tanbin1661@126.com

糖尿病血管病變是糖尿病主要的慢性并發(fā)癥之一。高血糖能通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，加速細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損，從而引起動脈粥樣硬化(As)的發(fā)生［1］。瓜蔞皮(亦稱栝樓皮)是葫蘆科植物栝樓或者雙邊栝樓等的果皮，具有清熱化痰，利氣寬胸的功效，主要用于治痰熱咳嗽、咽痛、胸悶、消渴等疾?。?］。前期研究表明，瓜蔞皮提取物能通過清除自由基，減少一氧化氮(NO)的滅活，對糖尿病大鼠血管內(nèi)皮有保護作用［3］，但并未對其保護機制做詳細(xì)的闡述。高血糖時的活性氧等因素?fù)p害血管內(nèi)皮，導(dǎo)致其抗氧化能力降低［4］，而高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激能通過激活核因子NF-κB途徑，促使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，釋放各種細(xì)胞因子，引發(fā)一系列的病理改變，最終導(dǎo)致疾病發(fā)生［5］。因此本研究在前期實驗的基礎(chǔ)上進一步分離瓜蔞皮有效成分，采用高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型，探討瓜蔞皮對內(nèi)皮細(xì)胞的保護機制是否涉及NF-κB途徑。

1　材料

1.1藥材及細(xì)胞株實驗用瓜蔞皮購自湖南省郴州市老百姓大藥房(經(jīng)湖南省郴州市藥品檢驗所黃麗彬副主任中藥師鑒定為葫蘆科植物栝樓干燥成熟果皮);人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株HUVECs(編號: C-003-5C)，購自中國科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所上海細(xì)胞庫。

1.2主要試劑胰蛋白酶，武漢亞法生物技術(shù)公司; DMEM培養(yǎng)基，Hyclone公司;胎牛血清(FBS)，浙江杭州四季青公司; MTT，Sigma公司;細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所，批號: C0003; NF-κB激活－核轉(zhuǎn)運檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所，批號: SN368; caspase-3活性檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所，批號: C1115; NF-κB p65抗體，Abcam公司，批號: ab16502;其余試劑均為市售分析純產(chǎn)品。

1.3儀器MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋公司)，CXK41熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)，JHT-DDC超凈工作臺(山東省濟南潔康設(shè)備廠)，熒光酶標(biāo)儀(Thermo公司)，Mini-Protean Tetra System(美國Bio-Rad公司)，TGL-16G-A臺式低溫離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，LS-B50L-Ⅰ立式壓力蒸汽滅菌器(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司)，F(xiàn)A1604電子分析天平(上海精密儀器公司)。

2　方法

2.1藥物的制備將100 g瓜蔞皮粉碎，用70 %的乙醇冷凝回流，將回流所得溶液濃縮后用氯仿萃取，再將萃取液濃縮至浸膏。采用硅膠柱層析法分離所得浸膏，選用極性較大的甲醇:氯仿系統(tǒng)作為洗脫劑。收集中間層即得瓜蔞皮有效成分(extractvie pericarpium trichosanthes，EPT)，再將其濃縮回流，所得浸膏靜置在空氣流通處揮干，得到樣品5. 89 g。用DMSO配制成儲備液(50 g·L－1)，DMSO終濃度控制在0.1 %。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)HUVECs接種于含10 %胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶的80%時，用2. 5 g·L－1的胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)基終止消化，均勻接種于6孔或96孔的培養(yǎng)板中。

2.3實驗分組實驗分為4組:①正常對照組(Control):實驗中不加任何物質(zhì)干擾;②高糖損傷組(Glucose):在細(xì)胞培養(yǎng)系中加終濃度為30 mmol ·L－1的葡萄糖;③EPT預(yù)處理組(+ EPT):在細(xì)胞培養(yǎng)系中預(yù)先用終濃度為12. 5、25、50 mg·L－1EPT預(yù)處理1 h，再加30 mmol·L－1葡萄糖和終濃度為12. 5、25、50 mg·L－1EPT繼續(xù)共培養(yǎng);④高滲組(Mannitol):在細(xì)胞培養(yǎng)系中加終濃度為30 mmol· L－1甘露醇。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后檢測相應(yīng)指標(biāo)。

2.4 MTT法檢測HUVECs細(xì)胞的存活率收集對數(shù)生長期的HUVECs，以1×105·L－1的密度接種于96孔板。貼壁24 h后，同步化12～24 h，分別按上述實驗分組培養(yǎng)48 h，加入20 μL 5 g·L－1MTT，使其終濃度為0. 5 g·L－1，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸取各孔培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，微震蕩15 min，選擇490 nm為測定波長，用酶標(biāo)儀測量各孔的OD值，以無細(xì)胞孔為空白對照，每組6個復(fù)孔，重復(fù)3次。以對照組為100%。

2.5 Hoechst 33258熒光染色觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)改變將細(xì)胞按實驗分組處理后，去除各孔上清液加入固定液，固定15 min后用PBS洗兩遍，再加入Hoechst 33258染色液，染色5 min后用PBS洗兩遍，滴一滴抗熒光淬滅封片液，激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm，于熒光顯微鏡下觀察藍色細(xì)胞核，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白，用軟件Image J計算細(xì)胞凋亡率。

2.6比色法測定細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活性分別收集各組細(xì)胞，PBS洗兩次，600×g 4℃離心5min收集細(xì)胞，PBS洗1次，按每2×106個細(xì)胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min，4℃20 000×g離心15 min。把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中，Bradford法測定蛋白濃度。各組取相同量蛋白，分別加入10 μL Ac-DEVD-pNA(2 mmol·L－1)后混勻，37℃孵育120 min，用酶標(biāo)儀于405 nm波長處測定其吸光度值，結(jié)果以各組與正常對照組比值表示。

2.7 Western blot法檢測NF-κB p65蛋白的表達

提取貼壁細(xì)胞總蛋白并通過考馬斯亮藍法測定其蛋白含量。所提細(xì)胞總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后以β-actin為內(nèi)參照，兔抗羊NF-κB p65-IgG為一抗，通過Western blot法測定其NF-κB p65相對表達量，實驗重復(fù)3次。

2.8 NF-κB核移位檢測吸除培養(yǎng)液，PBS洗1次，加固定液固定15 min后，洗滌液洗滌3次，每次3 min，加免疫染色封閉液，室溫封閉1 h后去除封閉液，加入NF-κB p65抗體，4℃孵育過夜，而后洗滌3次，再加入抗兔Cy3，室溫孵育1 h后洗滌，加入細(xì)胞核染色液(DAPI)，室溫染色5 min，吸除染色液洗滌，滴加適量的抗熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡下觀察NF-κB染色為紅色熒光，細(xì)胞核染色為藍色熒光。

2.9統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理，數(shù)據(jù)用±s表示。組間差異顯著性采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間的兩兩比較采用LSD法。

3　結(jié)果

3.1 EPT對高糖處理HUVECs存活率的影響

高糖處理明顯抑制HUVECs細(xì)胞活力(P＜0. 01)。不同濃度EPT處理48 h后，HUVECs的存活率較高糖組明顯升高，呈劑量依賴性(P＜0. 05或P＜0. 01)，由此推測，EPT可明顯拮抗高糖誘導(dǎo)的HUVECs損傷(Fig 1)。

3.2 EPT對高糖處理HUVECs凋亡的影響高糖孵育48 h后，HUVECs凋亡細(xì)胞明顯增加(P＜0. 01)。不同濃度EPT處理48 h后，凋亡細(xì)胞較高糖組明顯減少，呈劑量依賴性(P＜0. 05或P＜0. 01)。甘露醇組凋亡細(xì)胞與正常對照組相近，說明滲透壓對HUVECs凋亡影響不大(Fig 2)。

3.3 EPT對高糖誘導(dǎo)HUVECs caspase-3活性的影響以O(shè)D405反映caspase-3活性強弱。與正常對照組比較，高糖組caspase-3活性明顯升高(P＜0. 01)。與高糖組比較，不同濃度EPT組內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3活性呈現(xiàn)劑量依賴性降低(P＜0. 05或P＜0. 01)。甘露醇組caspase-3活性與正常對照組相近，說明滲透壓對HUVECs caspase-3活性影響不大(Fig 3)。

Fig 1　Effect of EPT on high glucose-induced cellular viability in human umbilical vein endothelial cells(±s，n =6)1: Control; 2: Glucose 30 mmol·L－1; 3: + EPT 12.5 mg·L－1; 4: + EPT 25 mg·L－1; 5: + EPT 50 mg·L－1; 6: Mannitol 30 mmol· L－1，*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs Glucose group.

3.4 EPT對高糖誘導(dǎo)HUVECs NF-κB p65蛋白表達水平的影響與正常對照組比較，高糖組NF-κB p65蛋白表達明顯增加(P＜0. 01)。與高糖組比較，不同濃度EPT組HUVECs NF-κB p65蛋白表達呈劑量依賴性降低(P＜0. 05或P＜0. 01)。滲透壓對HUVECs NF-κB p65蛋白表達影響不大(Fig 4)。

3.5 EPT對高糖誘導(dǎo)HUVECs NF-κB核移位的影響紅色熒光為Cy3標(biāo)記的NF-κB p65蛋白，藍色熒光為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核雙鏈DNA。與正常對照組比較，高糖組NF-κB p65蛋白在細(xì)胞核中存在較多，說明NF-κB被激活，發(fā)生核移位(P＜0. 01)。與高糖組比較，不同濃度EPT組HUVECs NF-κB p65的激活、核移位呈劑量依賴性降低(P＜0. 05或P＜0. 01)(Fig 5)。

Fig 2　Effect of EPT on high glucose-induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells(±s，n =3)1: Control; 2: Glucose 30 mmol·L－1; 3: + EPT 12.5 mg·L－1; 4: + EPT 25 mg·L－1; 5: + EPT 50 mg·L－1; 6: Mannitol 30 mmol·L－1，＊＊P＜0. 01 vs Glucose group.

Fig 3　Effect of EPT on high glucose-induced Caspase-3 activity in human umbilical vein endothelial cells(±s，n =3)1: Control; 2: Glucose 30 mmol·L－1; 3: + EPT 12.5 mg·L－1; 4: + EPT 25 mg·L－1; 5: + EPT 50 mg·L－1; 6: Mannitol 30 mmol· L－1，*P＜0. 05，＊＊P＜0.01 vs Glucose group.

4　討論

瓜蔞皮是用于治療心血管疾病的有效中藥，《中藥志》中有記載瓜蔞皮可“寬胸散結(jié)、清化熱痰，用治痰熱咳嗽、心胸悶痛”［6］。動物實驗表明，瓜蔞皮提取物能有效降低高脂血癥大鼠血液中的TC和LDL-C，改善氧自由基代謝，調(diào)節(jié)血脂，降低血小板聚集，抑制血栓形成，保護血管內(nèi)皮［7－8］。我們前期實驗也證明，瓜蔞皮初提物對ox-LDL誘導(dǎo)的人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護作用，其保護作用與抑制氧化應(yīng)激，降低ADMA和TNF-α濃度，促進NO的分泌有關(guān)［9］，同時也初步探討了初提物對糖尿病大鼠血管內(nèi)皮的保護作用［3］，但其機制尚未清楚。因此，本實驗對瓜蔞皮有效成分做進一步分離，利用高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型，對其機制做了進一步探討。

Fig 4　Effect of EPT on high glucose-induced protein expression of NF-κB p65 in human umbilical vein endothelial cells(±s，n =3)1: Control; 2: Glucose 30 mmol·L－1; 3: + EPT 12.5 mg·L－1; 4: + EPT 25 mg·L－1; 5: + EPT 50 mg·L－1; 6: Mannitol 30 mmol· L－1，*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs Glucose group.

Fig 5　Effect of EPT on high glucose-induced nuclear translocation of NF-κB p65 in human umbilical vein endothelial cells(±s，n =3)1: Control; 2: Glucose 30 mmol·L－1; 3: + EPT 12.5 mg·L－1; 4: + EPT 25 mg·L－1; 5: + EPT 50 mg·L－1;6: Mannitol 30 mmol·L－1，*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs Glucose group.

內(nèi)皮功能障礙是糖尿病血管病變的關(guān)鍵因素之一［10］。研究顯示，高糖能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，影響血管內(nèi)皮完整性，導(dǎo)致血管并發(fā)癥［11］。本實驗表明，體外培養(yǎng)的HUVECs在高糖條件下48 h，細(xì)胞活力明顯下降，凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯增多。高濃度葡萄糖滲透壓較高，為避免滲透壓對實驗的影響，設(shè)置了可以造成同等高滲狀態(tài)的甘露醇組，實驗表明高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與其本身的代謝有關(guān)，而不是由于細(xì)胞外高滲狀態(tài)刺激引起的。瓜蔞皮提取物干預(yù)后，能明顯抑制高糖所致的細(xì)胞活力下降，并減少內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，提示瓜蔞皮提取物對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有較好的抑制作用。

NF-κB是具有重要生理功能的轉(zhuǎn)錄因子，近年研究表明，NF-κB在糖尿病血管并發(fā)癥中扮演了重要的角色。Heng等［12］通過建立動脈粥樣硬化高脂糖尿病大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠胸主動脈NF-κB的mRNA和蛋白表達明顯升高，2型糖尿病小鼠冠狀動脈內(nèi)皮功能障礙也與AGE/RAGE信號通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激激活NF-κB有關(guān)［13］。實驗證明，NF-κB的激活與氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡相關(guān)［14］，同時，龍石銀等［15］研究證實在H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中，NF-κB表達升高;間歇性高糖條件下也可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并激活NF-κB信號通路［16］。也有研究發(fā)現(xiàn)，在高糖作用下激活的NF-κB還可使COX-2表達上調(diào)，促進caspase-3活化誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［17］。本研究結(jié)果亦表明，高糖處理后，HUVECs NF-κB p65明顯從細(xì)胞質(zhì)移位與細(xì)胞核內(nèi)，NF-κB p65蛋白表達量明顯增加，凋亡效應(yīng)分子和執(zhí)行者caspase-3活性明顯增加，細(xì)胞凋亡率明顯升高。

瓜蔞皮提取物能明顯減少高糖誘導(dǎo)的caspase-3活性的增加，同時使NF-κB p65蛋白表達以及NF-κB p65核移位明顯下降，并且能減少HUVECs凋亡率。說明瓜蔞皮提取物可能通過抑制核因子NF-κB的活化，降低caspase-3的活性，抑制HUVECs凋亡，從而減輕高糖對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，發(fā)揮保護血管內(nèi)皮的作用。然而高糖對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是一個復(fù)雜的過程，瓜蔞皮對損傷的保護作用，其相應(yīng)機制以及臨床應(yīng)用價值都有待進一步深入系統(tǒng)的研究。

(致謝:感謝心血管研究湖南省重點實驗室及心腦血管天然藥物研究湖南省高校重點實驗室對本實驗給予的幫助。)

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Effects of extractive pericarpium trichosanthes on apoptosis of HUVECs induced by high glucose

LIU Si-yu，GU Bin，LU Xin-Hua，WANG Jun-jie，TAN Bin
(Dept of Pharmacology，Xiangnan University，Chenzhou Hunan 423000，China)

Abstract:Aim To study the inhibitory effects of extractive pericarpium trichosanthes(EPT)on high glucose-induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)and its underlining mechanisms.Methods HUVECs were cultured.Effects of EPT at different concentrations on the high-glucose-induced apoptosis in HUVECs were observed.The cell viability of HUVECs was determined by MTT colorimetric method.Cell apoptosis was identified by Hoechst staining.The intracellular activity of Caspase-3 was detected with colorimetry.Protein expression and p65 nuclear translocation of NF-κB were detected by Western blot and immunofluorescence staining.Results Treated with 30 mmol·L－1glucose for 48 hours had a significantly decrease on cell viability compared with control，and the apoptotic rate and Caspase-3 activity were increased markedly，the protein expression of NF-κB was upregulated and p65 nuclear translocation in HUVECs increased; Pre-incubation with EPT(12. 5，25，50 mg·L－1)for 1 hour enhanced the cell viability，and decreased the apoptotic rate and Caspase-3 activity and downregulated the expression of NF-κB in a dose-dependent manner.Moreover，EPT could inhibit p65 translocation.Conclusion EPT can protect HUVECs against the apoptosis induced by high glucose in vitro，and its mechanism may be related with downregulation of NF-κB expression and inhibition of the intracellular activity of Caspase-3.

Key words:extractive pericarpium trichosanthes(EPT); high glucose; HUVECs; apoptosis; NF-κB; Caspase-3; MTT

作者簡介:劉思妤(1981－)，女，博士生，講師，研究方向:心血管及中藥藥理學(xué)，Tel: 0735-2653160，E-mail: siruner @ 163.com;

基金項目:湖南省中醫(yī)藥管理局重點基金項目(No 201227);湖南省衛(wèi)生廳科研基金項目(No B2011-073);湖南省教育廳十二·五重點建設(shè)學(xué)科基金項目資助(No湘教發(fā)［2011］76 號);湖南省心腦血管天然藥物研究重點實驗室基金項目資助(No湘教通［2008］246號)

收稿日期:2015－04－07，修回日期:2015－05－06

文獻標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－0988－06

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.020