Treg在慢性阻塞性肺疾病患者外周血及肺組織中的表達(dá)

章穎妹，嚴(yán) 青，劉 輝，石建邦，夏淮玲，徐曉玲

Treg在慢性阻塞性肺疾病患者外周血及肺組織中的表達(dá)

章穎妹，嚴(yán) 青，劉 輝，石建邦，夏淮玲，徐曉玲

摘要目的 觀察慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者外周血及肺組織中調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）的表達(dá)并與肺功能正常者進(jìn)行對(duì)照比較，探討Treg在COPD患者氣道炎癥中的作用以及吸煙對(duì)其表達(dá)的影響。方法 收集24例肺功能正常的不吸煙者（NS組）、22例肺功能正常的吸煙者（S組）、25例患有COPD的吸煙者（COPD組）為研究對(duì)象，分別采用流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)3組研究對(duì)象外周血及肺組織中Treg表達(dá)。結(jié)果 COPD組的外周血中Treg表達(dá)均顯著高于S組及NS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），S組的外周血Treg表達(dá)高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；COPD組的肺組織中Treg表達(dá)均顯著低于S組及NS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），S組的肺組織中Treg表達(dá)水平低于NS組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3組外周血Treg總表達(dá)與第1秒用力呼氣容積（FEV1）／預(yù)計(jì)值（%）負(fù)相關(guān)（P＜0.000 1），與吸煙量（年支）呈顯著正相關(guān)（P＜0.000 1），3組肺組織中Treg總表達(dá)與FEV1／預(yù)計(jì)值（%）無(wú)相關(guān)性（P＝0.338），與吸煙量（年支）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＝0.031）。結(jié)論 COPD患者外周血中Treg表達(dá)上調(diào)，其肺組織中Treg表達(dá)下調(diào)。吸煙量與外周血中Treg表達(dá)呈正相關(guān)，與肺組織中Treg表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

關(guān)鍵詞T淋巴細(xì)胞；調(diào)節(jié)性；慢性阻塞性肺疾??；吸煙；氣道炎癥

2015-02-02接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院呼吸內(nèi)科，合肥 230001

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是氣道慢性炎癥性疾病，以不完全可逆、進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限為特征的疾病，發(fā)病機(jī)制未明確。目前主要認(rèn)為吸煙為COPD主要危險(xiǎn)因素，但是在所有吸煙者中只有近乎50%為COPD［1］。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（regulatory T lymphocytes，Treg）是一個(gè)CD4＋T細(xì)胞亞群，其主要功能為調(diào)節(jié)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞和維持自身免疫功能平衡［2］，叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子（forkhead box P3，F(xiàn)oxp3）的表達(dá)可作為其標(biāo)志分子。近年研究［3］提示Treg可能參與調(diào)節(jié)吸煙煙霧等有害氣體或顆粒誘導(dǎo)的氣道免疫炎癥反應(yīng)。該研究旨在觀察COPD患者外周血及肺組織中Treg表達(dá)并與肺功能正常者進(jìn)行對(duì)照比較，探討Treg在COPD患者氣道炎癥中的作用以及吸煙對(duì)其表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1 病例資料 收集安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院2012年1月～2013年12月胸外科行肺部切除手術(shù)的71例患者，男女不限，年齡＞35歲。根據(jù)患者的術(shù)前肺功能檢查結(jié)果以及患者吸煙史，分為肺功能正常不吸煙組（NS組，n＝24），肺功能正常吸煙組（S組，n＝22），患有COPD吸煙組（COPD組，n＝25）。COPD定義根據(jù)《慢性阻塞性肺疾病診治指南》（2007年修訂版）［4］診斷標(biāo)準(zhǔn)，吸入支氣管舒張劑后第一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）／用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）＜70%；排除標(biāo)準(zhǔn)（滿足其中之一）：①患有風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病或者自身免疫缺陷者或過(guò)敏

性疾病如支氣管哮喘；②合并肺部及其他系統(tǒng)感染；③1個(gè)月內(nèi)服用糖皮質(zhì)激素；④術(shù)前已行放療或化療；⑤結(jié)合術(shù)后病理患有病毒性疾病或結(jié)核性疾病。

1.2 主要試劑和儀器 淋巴分離液（北京索來(lái)寶公司）；RMPI 1640培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）；抗人CD4-FITC單克隆抗體、抗人CD25-PE單克隆抗體、抗人Foxp3-PECy5單克隆抗體、固定破膜劑（美國(guó)eBioscience公司）；濃縮型鼠抗人Foxp3單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）；SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司）；肺功能儀（美國(guó)森迪斯公司）；高水平冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 抽取受試者清晨空腹靜脈血2 ml置于肝素抗凝管中，PBS與血液等比稀釋，平鋪于淋巴分離液之上，2 500 r／min離心30 min后提取白膜層至流式管中，加入PBS，2 000 r／min離心20 min，棄上清液。加RMPI培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為2×106／ml，取100 μl至流式管，分別先后加入CD4-FITC、CD25-PE、破膜劑、Foxp3-PECy5，避光孵育、洗滌，棄上清液，上機(jī)檢測(cè)。分析軟件為Flow Jo 7.6，應(yīng)用散點(diǎn)圖，設(shè)門，分析Treg占CD4＋T細(xì)胞百分比。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè) 選取安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院胸外科符合入選標(biāo)準(zhǔn)患者的術(shù)后新鮮肺組織標(biāo)本，常規(guī)行石蠟切片，厚約3 μm，首先行HE染色；然后免疫組化染色按試劑說(shuō)明書(shū)行SP二步法染色。光鏡下計(jì)數(shù)和攝片。Foxp3的陽(yáng)性信號(hào)主要定位于細(xì)胞核上呈棕黃色或者黃褐色顆粒狀。染色評(píng)估采用半定量積分法：光鏡下（400倍）觀察陽(yáng)性細(xì)胞染色比例（0：＜5%；1：5%～25%；2：26% ～50%；3：51%～75%；4：＞76%）以及染色強(qiáng)度（0：基本不著色；1：淺黃色；2：棕黃色；3：棕褐色），將這兩項(xiàng)得分相乘得出最后的評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，3組間的差異運(yùn)用One-Way ANOVA檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)，而不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。

2　結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般情況特點(diǎn) 與NS組及S組比較，COPD組FEV1／預(yù)計(jì)值（%）、FEV1／FVC（%）減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），S組FEV1／預(yù)計(jì)值（%）與NS組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，S組FEV1／FVC（%）與NS組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；COPD組吸煙量（年支）與S組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；COPD組年齡與S組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而NS組年齡與S組、COPD組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；此外，NS組中男女比例以女性為主，而S組與COPD組男性占絕大多數(shù)比例。見(jiàn)表1。

表1　各組研究對(duì)象一般資料（±s）

表1　各組研究對(duì)象一般資料（±s）

與NS組比較：**P＜0.01；與S組比較：＃＃P＜0.01

項(xiàng)目　NS組（n＝24）　S組（n＝22）　COPD組（n＝25）　F值年齡（歲）　48.17±15.398 59.32±10.987**63.88±9.034**10.844性別（男／女）　7／17　21／1　25／0吸煙量（年支）　0　834.09±571.420 864.00±538.424 28.277 FEV1／預(yù)計(jì)值（%）　94.87±14.032　90.64±9.781 65.24±17.025**＃＃31.619 FEV1／FVC（%）　84.39±4.851 76.27±4.108**59.88±8.303**＃＃101.993

2.2 外周血中Treg表達(dá) 3組間的外周血中Treg表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1。COPD組外周血Treg表達(dá)顯著高于S組及NS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；S組外周血Treg表達(dá)高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

2.3 肺組織中Treg表達(dá) 3組間的肺組織中Treg （Foxp3＋）表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。Treg在COPD組的肺組織中表達(dá)顯著低于S組及NS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；S組的

肺組織中Treg表達(dá)低于NS組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。2.4 相關(guān)性分析 ①3組資料匯總分析，外周血Treg總表達(dá)與FEV1／預(yù)計(jì)值（%）呈負(fù)相關(guān)（Pearson相關(guān)）（r＝-0.541，P＜0.000 1）；外周血Treg總表達(dá)與吸煙量（年支）呈正相關(guān)（Pearson相關(guān)）（r＝0.616，P＜0.000 1）。②3組資料匯總分析，肺組織Treg總表達(dá)與FEV1／預(yù)計(jì)值（%）之間無(wú)相關(guān)性（Spearman秩相關(guān)）（rs＝0.115，P＝0.338）；肺組織Treg總表達(dá)與吸煙量（年支）呈負(fù)相關(guān)（Spearman秩相關(guān)）（rs＝-0.256，P＝0.031）。

表2　各組的Treg在外周血、肺組織中的表達(dá)（±s）

表2　各組的Treg在外周血、肺組織中的表達(dá)（±s）

與NS組比較：**P＜0.01；與S組比較：＃＃P＜0.01

項(xiàng)目　NS組　S組　COPD組　F值外周血Treg（%）　2.14±0.82 3.97±1.13**　5.50±1.00**＃＃45.33肺組織Treg（分）　3.67±1.71 3.23±2.02　2.20±1.26**＃＃4.94

3　討論

目前認(rèn)為COPD的主要病理特征為小氣道壁上多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，炎癥導(dǎo)致氣道壁的損失-修復(fù)過(guò)程反復(fù)發(fā)生，進(jìn)而引起氣道結(jié)構(gòu)重塑，導(dǎo)致COPD氣流受限的主要病理基礎(chǔ)之一。研究［5］不僅證實(shí)COPD小氣道壁上存在上述炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，小氣道壁厚與FEV1／預(yù)計(jì)值（%）呈負(fù)相關(guān)，且發(fā)現(xiàn)COPD疾病進(jìn)展與CD8＋T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，提示COPD存在著獲得性免疫介導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)。而Treg通過(guò)產(chǎn)生和誘導(dǎo)各種細(xì)胞因子（如IL-10、TGF-β、IL-4、IFN-γ等）在COPD氣道炎癥中發(fā)揮著重要的抗炎作用。本研究結(jié)果顯示COPD組外周血中Treg表達(dá)比S組、NS組顯著升高，與Smyth et al［6］研究結(jié)果一致，而與Wang et al［7］研究結(jié)果不一致。目前認(rèn)為COPD不僅僅表現(xiàn)為氣道和肺的異常炎癥反應(yīng)，也有顯著的全身效應(yīng)，如Gan et al［8］的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，炎癥性細(xì)胞因子（包括TNF-α、IL-6、IL-8、IL-18、CRP等）濃度在COPD患者外周血中升高，并且隨著疾病進(jìn)展更加顯著。本研究中COPD組及S組外周血中Treg高表達(dá)，與吸煙量呈正相關(guān)，可能與香煙煙霧直接與間接刺激下外周血中存在持續(xù)炎癥介質(zhì)，Treg在外周血中發(fā)揮持續(xù)抗炎作用有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示COPD組的肺組織中Treg表達(dá)比S組、NS組顯著減低；S組的肺組織中Treg表達(dá)比NS組稍減低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Isajevs et al［9］的研究結(jié)果一致，不同的是其研究結(jié)果顯示吸煙組的小氣道中Foxp3＋表達(dá)比不吸煙組升高。亦與Chu et al［10］的研究結(jié)果一致。此外，本研究中S組與COPD組的吸煙量（年支）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然而相同吸煙強(qiáng)度暴露下，某些吸煙者能夠維持正常的肺功能，有些卻發(fā)展為COPD。Cosio et al［11］從分子免疫角度闡述COPD疾病進(jìn)展與體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制（Treg與γδ CD8＋T細(xì)胞）功能損傷程度呈正相關(guān)。結(jié)合以上研究推測(cè)，肺功能正常吸煙者及COPD患者肺組織中Treg表達(dá)降低引起Treg免疫調(diào)節(jié)抑制、抗炎等功能受損，導(dǎo)致機(jī)體氣道炎癥、重塑等COPD病理改變而無(wú)法維持正常的肺功能及肺功能進(jìn)一步下降。這些本研究中目前肺功能正常的吸煙者仍是罹患COPD高危人群。

綜上所述，本研究顯示COPD患者外周血中Treg表達(dá)上調(diào)，其肺組織中Treg表達(dá)下調(diào)；吸煙量與外周血中Treg表達(dá)呈正相關(guān)，與肺組織中Treg表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。本研究反映Treg在COPD外周血與肺內(nèi)表達(dá)不一致，為其在COPD外周及氣道炎癥中作用提供理論依據(jù)；Treg在肺功能正常吸煙者及不吸煙者外周血與肺內(nèi)表達(dá)不同，也為香煙煙霧暴露人群易患COPD的發(fā)病機(jī)制的探討提供新的線索。［1］ Mannino D M，Buist A S.Global burden of COPD：risk factors，prevalence，and future trends［J］.Lancet，2007，370（9589）：765-73.

參考文獻(xiàn)

［2］ Jiang H，Chess L.An integrated view of suppressor T cell subsets in immunoregulation［J］.J Clin Invest，2004，114（9）：1198-208.

［3］ Brusselle G G，Joos G F，Bracke K R.New insights into the immunology of chronic obstructive pulmonary disease［J］.Lancet，2011，378（9795）：1015-26.

［4］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南（2007年修訂版）［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2007，30（1）：8-17.

［5］ Hogg J C，Chu F，Utokaparch S，et al.The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease［J］.N Engl J Med，2004，350（26）：2645-53.

［6］ Smyth L J，Starkey C，Vestbo J，et al.CD4-regulatory cells in COPD patients［J］.Chest，2007，132（1）：156-63.

［7］ Wang H，Peng W，Weng Y，et al.Imbalance of Th17／Treg cells in mice with chronic cigarette smoke exposure［J］.Int Immunopharmacol，2012，14（4）：504-12.

［8］ Gan W Q，Man S F，Senthilselvan A，et al.Association between chronic obstructive pulmonary disease and systemic inflammation：a systematic review and a meta-analysis［J］.Thorax，2004，59 （7）：574-80.

［9］ Isajevs S，Taivans I，Strazda G，et al.Decreased FOXP3 expression in small airways of smokers with COPD［J］.Eur Respir J，2009，33（1）：61-7.

［10］Chu S，Zhong X，Zhang J，et al.The expression of Foxp3 and ROR gamma t in lung tissues from normal smokers and chronic obstructive pulmonary disease patients［J］.Int Immunopharmacol，2011，11（11）：1780-8.

［11］Cosio M G，Saetta M，Agusti A.Immunologic aspects of chronic obstructive pulmonary disease［J］.N Engl J Med，2009，360 （23）：2445-54.

The expression of Treg in peripheral blood and lung tissue of COPD

Zhang Yingmei，Yan Qing，Liu Hui，et al
（Dept of Respiratory Medicine，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

AbstractObjective To observe the expression of regulatory T lymphocytes（Treg）in peripheral blood and lung tissue of patients with chronic obstructive pulmonary disease（COPD）and investigate the role of Treg in the airway inflammation of COPD and how smoking impacts the expression of Treg compared with population of normal lung function.Methods A total of 24 subjects were nonsmokers with normal lung function（NS group），22 subjects were smokers with normal lung function（S group）and 25 subjects were smokers with COPD（COPD group）.The percentage of Treg in peripheral blood was measured by flow cytometry，and the immune-histochemical methods were used to evaluate Treg expression in lung tissue.Results The percentage of Treg in peripheral blood significantly increased in COPD group compared with S group and NS group，the difference was statistically significant（P ＜0.01）；the percentage of Treg in peripheral blood significantly increased in S group compared with NS group，the difference was statistically significant（P＜0.01）；the Treg levels in lung tissue were significantly decreased in COPD group between S group and NS group，the difference was statistically significant（P＜0.01）.The Treg levels in lung tissue were significantly decreased in S group between NS group，the difference was not statistically significant.The total percentage of Treg in peripheral blood with FEV1%pred was a negative correlation（P＜0.000 1），and there was a positive correlation with smoking index（P＜0.000 1）；there was no significant correlation between Treg levels in total of lung tissue with FEV1%pred（P＝0.338），but with smoking index there was a negative correlation（P＝0.031）.Conclusion In COPD patients，the percentage of Treg in peripheral blood is up-regulated，but Treg levels in lung tissue are down-regulated.There is a positive correlation between smoking index and the percentage of Treg，but it is negatively correlated with Treg levels in lung tissue.

Key wordsT lymphocytes；regulatory；chronic obstructive pulmonary disease；smoking；airway inflammation

作者簡(jiǎn)介：章穎妹，女，碩士研究生；徐曉玲，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xxlahh08＠163.com

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1208085MH158）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）05-0679-04

中圖分類號(hào)R 563.3