張春玉

（1.長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院，吉林 長(zhǎng)春130033；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130024）

作物產(chǎn)量經(jīng)常受到干旱等非生物脅迫因素的影響，而植物在響應(yīng)滲透脅迫的過程中常會(huì)出現(xiàn)脯氨酸的積累；已有的研究表明，脯氨酸在植物應(yīng)對(duì)脅迫的過程中發(fā)揮了重要的抗逆作用［1－3］.植物體內(nèi)脯氨酸的合成主要有兩條途徑：一條是以谷氨酸為底物合成脯氨酸，催化此途徑的酶是Δ1－吡咯啉－5－羧酸合成酶（P5CS）和Δ1－吡咯啉－5－羧酸還原酶（P5CR）；另一條途徑是以鳥氨酸為底物合成脯氨酸，催化此途徑的酶是鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（δ－OAT）和Δ1－吡咯啉－5－羧酸合成酶（P5CR）.脯氨酸的降解則由脯氨酸脫氫酶（Prodh）催化和Δ1－吡咯琳－5－羧酸脫氫酶（P5CDH）調(diào)控［4－5］.研究表明，脯氨酸合成過程中相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)有利于葉片中游離脯氨酸的積累，如Roosens等將鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（δ－OAT）基因用于煙草植株的轉(zhuǎn)化，結(jié)果證明與非轉(zhuǎn)化植株相比，葉片脯氨酸含量明顯升高，即鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（δ－OAT）基因轉(zhuǎn)化植株的后代對(duì)脯氨酸的積累能力顯著增強(qiáng).

雖然脯氨酸的積累是逆境條件下最常見的生理反應(yīng)，常被作為衡量抗逆性強(qiáng)弱的指標(biāo).但是其確切機(jī)理仍不清楚［4］.最新的研究表明，逆境脅迫（如干旱、冷害和鹽堿）能夠改變植物基因組DNA 甲基化水平，這表明DNA 甲基化與植物的抗逆性有關(guān)［6］.為了研究逆境脅迫下DNA 甲基化是否參與了脯氨酸的累積，本文首次從表觀遺傳學(xué)角度探討了聚乙二醇（PEG）脅迫下DNA 甲基化與脯氨酸代謝之間可能存在的相關(guān)性，對(duì)于深入研究逆境條件下脯氨酸代謝的表觀遺傳學(xué)機(jī)制具有重要意義.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物材料

水稻（Oryza sativa L.）粳稻品種——松前.

1.1.2 材料的處理

隨機(jī)選取松前S0代和S1代（S0的自交后代）種子各30粒進(jìn)行培養(yǎng).待苗長(zhǎng)到三葉一心時(shí)，將S0代和S1代植株分別分成兩組：一組為對(duì)照組，不進(jìn)行PEG 脅迫；另一組為處理組.選取15%的PEG 模擬干旱脅迫處理，在處理期間每天更換新的處理液以保證處理濃度的均一性的，脅迫處理4d后，分別取處理組和對(duì)照組的葉片，在液氮中冷凍后置于－70℃冰箱中保存待用.

1.1.2 營(yíng)養(yǎng)液

1.44 mmol／L （NH4）2SO4，0.32 mmol／L NaH2PO4，0.6 mmol／L K2SO4，1.0 mmol／L CaCl2，1.6mmol／L MgSO4，0.072mmol／L EDTA，0.2mmol／L Na2SiO3，9.1mmol／L MnCl2，0.154μmol／L ZnSO4，0.156μmol／L CuSO4，18.5μmol／L H3BO3，0.526μmol／L H2MoO4.pH＝5.2.

1.2 技術(shù)路線

1.2.1 松前基因組總DNA 提取

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法［7］.

1.2.2 松前的DNA 甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）檢測(cè)

參照Xiong等報(bào)道的方法［8］，以上述提取的松前DNA 為模板，對(duì)S0代進(jìn)行DNA 甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性檢測(cè)，雙酶切組合為EcoRⅠ／MspⅠ和EcoRⅠ／HpaⅡ，接頭、預(yù)擴(kuò)增及選擴(kuò)增引物序列如表1所示.

表1 松前擴(kuò)增MSAP中接頭序列、預(yù)擴(kuò)增引物和選擇性擴(kuò)增引物組合

續(xù)表1

1.2.3 松前總RNA 的提取

參照Lepz等方法提取松前總RNA［9］.

1.2.2 松前總RNA 反轉(zhuǎn)錄

以上述提取的松前總RNA 為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如表2所示.反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃，10min；42℃，30min；99℃，5min.

表2 10μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

1.2.3 脯氨酸代謝相關(guān)基因的Southern印跡雜交檢測(cè)

用限制性內(nèi)切酶消化水稻當(dāng)代變異最大的單株S0及其后代S1代單株葉片的基因組DNA，進(jìn)行脯氨酸代謝相關(guān)基因的Southern印跡雜交檢測(cè).

1.2.4 脯氨酸代謝相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Realtime－PCR）

以上述反轉(zhuǎn)錄獲得的水稻樣品的cDNA 為模板，按照表3提供的引物，采用熒光染料（SYBR Green）三步法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Realtime－PCR）擴(kuò)增.反應(yīng)體系如表4所示.反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，1min；95℃，5s；58℃～60℃，10s；72℃，30s.40個(gè)循環(huán).

表3 用于擴(kuò)增松前的轉(zhuǎn)座子和基因的探針的引物

1.2.5 游離脯氨酸含量的測(cè)定

按照Bates等方法測(cè)定樣品葉片中游離脯氨酸的含量［10］.

2 結(jié)果與分析

2.1 松前S0 代甲基化變異最大的單株

對(duì)隨機(jī)選取的S0代的14個(gè)單株進(jìn)行DNA 甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性檢測(cè)，采用EcoRⅠ＋MspⅠ選擇性擴(kuò)增引物組合（19對(duì)）擴(kuò)增出了956條清晰可辨的條帶.結(jié)果表明，S0代的14個(gè)單株的CHG 甲基化水平和模式均發(fā)生了變異，但是CG 甲基化卻沒有發(fā)生變異.CHG 總甲基化變異范圍為0.2%～8%，結(jié)果如圖1所示.根據(jù)以上的檢測(cè)結(jié)果，篩選出甲基化變異最明顯的第4株（變異率為8%）進(jìn)行后續(xù)的研究，記作S0，S0的自交后代記為S1.

表4 松前的Realtime－PCR反應(yīng)體系（10μL）

圖1 PEG 脅迫S0 代DNA甲基化模式變異

2.2 S0 和S1 代脯氨酸代謝相關(guān)基因的Southern印跡雜交的檢測(cè)

為了進(jìn)一步明確脯氨酸代謝相關(guān)基因P5CS、δ－OAT、P5CR 以 及P5CDH 在S0和S1代所發(fā)生的DNA 甲基化變異特征，利用Southern印跡雜交技術(shù)檢測(cè)S0代和S1代的14個(gè)單株的DNA 甲基化水平，結(jié)果見圖2.結(jié)果表明：這些基因在S0代，CHG、CG 甲基化均未發(fā)生變異.S1代Δ1－吡咯啉－5－羧酸合成酶（P5CS）基因甲基化變異率為100%（全部發(fā)生去甲基化變異）；鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（δ－OAT）基因甲基化變異率約為21%（3個(gè)單株發(fā)生去甲基化變異，11個(gè)單株沒有變化）；脯氨酸合成途徑Δ1－吡咯啉－5－羧酸合成酶（P5CR）基因和脯氨酸降解途徑基因Δ1－吡咯啉－5－羧酸脫氫酶（P5CDH）基因的甲基化變異率為0（S1代沒有發(fā)生甲基化變化）.

2.3 S0 代和S1 代葉片的脯氨酸代謝基因的

DNA甲基化變異與基因表達(dá)的相關(guān)性

（1）Δ1－吡咯啉－5－羧酸合成酶（P5CS）基因的表達(dá).與對(duì)照相比，S0代P5CS基因表達(dá)上調(diào)得不明顯，S1代所有單株P(guān)5CS基因的表達(dá)均上調(diào)，尤其是S1－8，S1－9和S1－10這3個(gè)單株的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），P5CS基因在S1后代中表達(dá)上調(diào)的比率為100%（見圖3A）.

圖2 S0 代和S1 代的Southern雜交結(jié)果

（2）鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（δ－OAT）基因的表達(dá).與對(duì)照相比，除S1－5，S0代和S1代其他13 個(gè)單株中δ－OAT 基因的表達(dá)均上調(diào)，上調(diào)的比率為71.4%.Southern印跡雜交的結(jié)果顯示S1－4，S1－9和S1－10這3個(gè)單株δ－OAT 基因發(fā)生了去甲基化變異；Realtime－PCR 結(jié)果顯示這3個(gè)單株對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)結(jié)果為上調(diào)，說明二者基本可以吻合.但是該基因的Southern 印跡雜交結(jié)果表明，S1代其他的11 個(gè)單株δ－OAT 基因沒有發(fā)生去甲基化變異，但是對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)卻有上調(diào)，這進(jìn)一步證明了僅是部分單株甲基化變異與基因的表達(dá)可能呈現(xiàn)相關(guān)性（見圖3B）.

圖3 S0 代和S1 代的Realtime－PCR檢測(cè)

（3）Δ1－吡咯啉－5－羧酸還原酶（P5CR）基因的表達(dá).與對(duì)照相比，S0代P5CR 基因表達(dá)上調(diào)，S1代P5CR基因表達(dá)上調(diào)率為71.4%，這與Southern印跡雜交的去甲基化變異率（0）不相符，表明P5CR 基因在S1代單株中的DNA 去甲基變異與該基因在S1代的表達(dá)不直接相關(guān)（見圖3C）.

（4）Δ1－吡咯啉－5－羧酸脫氫酶（P5CDH）基因的表達(dá).與對(duì)照相比，S0代P5CDH 基因表達(dá)上調(diào)，S1代P5CDH 基因表達(dá)下調(diào)率為7.1%，這與Southern印跡雜交0的去甲基化變異率之間存在一定的差距，表明P5CDH 基因的甲基化變異與基因表達(dá)也不存在直接相關(guān)（見圖3D）.

2.4 干旱脅迫對(duì)后代（S1 代）葉片游離脯氨酸含量的影響

前述的基因表達(dá)結(jié)果已經(jīng)表明，S1代所有植株的控制脯氨酸合成的關(guān)鍵基因Δ1－吡咯啉－5－羧酸合成酶（P5CS）表達(dá)均上調(diào).為了驗(yàn)證這個(gè)基因的DNA 甲基化變異及其基因表達(dá)的變化是否對(duì)脯氨酸的累積產(chǎn)生影響，分別對(duì)S0代和S1代葉片中游離脯氨酸含量進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果（見圖4）表明，與對(duì)照相比，無論是否經(jīng)過再次脅迫處理，在脅迫6h和4d時(shí)S1代葉片中的脯氨酸含量均高于對(duì)照；并且S1代在經(jīng)過再次脅迫處理時(shí)，葉片中脯氨酸含量明顯高于未脅迫狀態(tài)，而對(duì)照在經(jīng)過處理后脯氨酸含量沒有明顯的增強(qiáng).很多研究表明脯氨酸可以作為植物抗逆的指標(biāo)之一［3，13］，因此，這也表明經(jīng)過脅迫處理的后代植株S1代的抗旱性有所增強(qiáng).

圖4 S0 代和S1 代的脯氨酸含量

3 討論與結(jié)論

植物的生長(zhǎng)發(fā)育是在遺傳和環(huán)境因素以及二者的相互作用下，通過極其復(fù)雜的生理和生化過程完成的.逆境尤其是干旱可以引起植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的增加，而脯氨酸含量是否可以作為植物抗旱適應(yīng)性和育種的指標(biāo)一直存在爭(zhēng)議.但是很多研究表明，水稻受到干旱脅迫后脯氨酸的累積有利于水稻抗逆性的提高.引起脯氨酸累積的可能原因主要是脯氨酸合成途徑被激活、氧化降解途徑受到抑制或合成途徑的原料供應(yīng)受阻［11－13］.

本研究發(fā)現(xiàn)：（1）S1代脯氨酸合成途徑部分基因的DNA 甲基化變異與基因表達(dá)可能存在一定的相關(guān)性，但是否就是由于Δ1－吡咯啉－5－羧酸合成酶（P5CS）和鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（δ－OAT）基因的去甲基化變異激活了基因的表達(dá)而導(dǎo)致表達(dá)量上調(diào)還不能明確定論，因?yàn)槊傅幕钚允艿睫D(zhuǎn)錄和翻譯的共同調(diào)控，因此還有待于在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證.但是我們獲得的信息表明，S1代中14個(gè)單株的Δ1－吡咯啉－5－羧酸合成酶（P5CS）基因甲基化的變化與基因表達(dá)呈現(xiàn)了一致性，3 個(gè)單株的鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（δ－OAT）基因的甲基化變異與基因的表達(dá)呈現(xiàn)了一致性，因而我們猜測(cè)DNA 甲基化極有可能參與了對(duì)Δ1－吡咯啉－5－羧酸合成酶（P5CS）和鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（δ－OAT）基因表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)而影響了脯氨酸的累積.（2）Δ1－吡咯啉－5－羧酸還原酶（P5CR）基因和Δ1－吡咯啉－5－羧酸脫氫酶（P5CDH）基因的表達(dá)可能并不受DNA 甲基化的調(diào)控.（3）DNA 甲基化變異可能只對(duì)脯氨酸部分特定基因的表達(dá)產(chǎn)生一定的影響.

本文的研究結(jié)果表明：表觀遺傳修飾如DNA 甲基化極有可能在植物響應(yīng)干旱脅迫時(shí)參與脯氨酸代謝的調(diào)節(jié)，并且這種代謝特性（基因表達(dá)水平和脯氨酸含量的變化）可按照一定的頻率遺傳給后代，因而可能在植物適應(yīng)干旱以及脅迫抗性獲得中發(fā)揮重要作用.本研究為DNA甲基化在脯氨酸代謝中的作用提供了一個(gè)可靠的證據(jù)，脅迫生物學(xué)的研究應(yīng)該更多地關(guān)注執(zhí)行抗性的生物活性的分子表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié).

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