中頻脈沖電流經(jīng)皮刺激肝區(qū)對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠肝細(xì)胞線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響

翟藝宗，黃昌林，常祺，王久清，張佳，郭延嶺

運(yùn)動(dòng)性疲勞是指因機(jī)體的生理過(guò)程不能維持在特定水平或機(jī)體不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度而導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)能力下降的現(xiàn)象[1]。肝臟作為人體最大的腺體，在物質(zhì)代謝、維持機(jī)體血糖恒定及供能方面有著重要作用。線粒體是真核細(xì)胞功能活動(dòng)的主要供能單位[2]，可通過(guò)其內(nèi)膜呼吸鏈的氧化磷酸化反應(yīng)為機(jī)體生成80%以上的ATP[3]，在維持肝臟細(xì)胞正常的能量代謝和功能方面具有重要作用。線粒體是適應(yīng)運(yùn)動(dòng)方式最為敏感的細(xì)胞器之一[4]，Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶位于線粒體內(nèi)膜中[5]，能維持線粒體膜電化學(xué)梯度[6]，是線粒體功能、結(jié)構(gòu)變化的靈敏指標(biāo)。本研究采用游泳力竭大鼠模型，應(yīng)用分子生化技術(shù)探討脈沖電流經(jīng)皮刺激肝區(qū)對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響，以進(jìn)一步探討脈沖電流經(jīng)皮刺激肝區(qū)緩解疲勞的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇健康8周齡雄性W istar大鼠72只，體重204±15g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)室溫度23±2℃，濕度41%±15%，自然光照，分籠飼養(yǎng)，自由攝食及飲水。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前均未進(jìn)行過(guò)游泳運(yùn)動(dòng)。

1.2 主要試劑及儀器 線粒體超微量Na+-K+-ATP酶及Ca2+-M g2+-ATP酶測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)；鹽酸氯胺酮注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H35020148，福建古田藥業(yè)有限公司)；LD5-2A離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型建立及分組 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為安靜對(duì)照組(A組)、疲勞對(duì)照組(B組)、疲勞前刺激組(C組)、疲勞后刺激組(D組)，每組18只。按組別分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前3d，每只大鼠每天學(xué)習(xí)游泳30m in，水溫32±1℃，水深70cm，隨后連續(xù)進(jìn)行5周實(shí)驗(yàn)。B、C、D組大鼠每周進(jìn)行游泳訓(xùn)練6d，休息1d，每日游泳2次，每次均達(dá)到力竭，當(dāng)

大鼠浮在水面不運(yùn)動(dòng)時(shí)用木棒驅(qū)趕，維持其運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。力竭標(biāo)準(zhǔn)以大鼠下沉后10s不露出水面為準(zhǔn)，記錄每只大鼠的游泳力竭時(shí)間。每組大鼠游泳后換水。B、D組大鼠在游泳后，C組大鼠在游泳前分別給予腹腔注射鹽酸氯胺酮注射液0.25g/kg麻醉。C組大鼠在游泳前、D組大鼠在游泳力竭后分別以頻率為1024Hz的脈沖電流刺激肝區(qū)，電流強(qiáng)度均為10m A，間動(dòng)周期為1s，時(shí)間均為20m in，2次/d。1.3.2 取材、標(biāo)本制備及指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠分別在1、3、5周末分批斷頭處死，每組各時(shí)間點(diǎn)6只，處死前動(dòng)物禁食水過(guò)夜。大鼠處死后立即剖腹取肝臟組織1g，用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩８闻K標(biāo)本溶化后仍保持2～8℃的溫度，眼科剪剪碎后，加入9m l PBS液(pH 7.4)，用超聲勻漿器將標(biāo)本充分勻漿，3000r/m in離心20m in，收集上清液，分裝后待檢測(cè)，整個(gè)操作過(guò)程均在0～4℃下進(jìn)行。采用分光光度法[7]測(cè)定1、3、5周各組動(dòng)物的肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，應(yīng)用UV-2450紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)其吸光度(A)值，波長(zhǎng)636nm，其結(jié)果用μkat/g表示。采用Brad food蛋白定量法測(cè)定[8]進(jìn)行大鼠肝臟線粒體蛋白定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠游泳力竭時(shí)間的比較 第1周末3組大鼠游泳力竭時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。第3、5周末D組大鼠游泳力竭時(shí)間均明顯長(zhǎng)于B組和C組(P＜0.05)，而B(niǎo)組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

2.2 各組大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的比較 第1周末4組大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。第3、5周末B組大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯低于其余3組，且C組大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯低于D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

表1 運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠游泳力竭時(shí)間(m in，±s，n=6)Tab. 1 The exhaustive sw imm ing tim e of exercise-induced fatigued rats (m in, ±s, n=6)

表1 運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠游泳力竭時(shí)間(m in，±s，n=6)Tab. 1 The exhaustive sw imm ing tim e of exercise-induced fatigued rats (m in, ±s, n=6)

(1)P＜0.05 com pared with group B; (2)P＜0.05 com pared with g roup C

Group Training tim e (w eek)1 3 5 B 94.59±8.51 101.72±7.23 111.59±8.42 C 93.80±10.89 105.46±9.89 119.18±10.27 D 97.26±11.62 115.35±12.19(1)(2)132.39±9.44(1)(2)

表2 各組大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比較(μkat/g，±s，n=6)Tab. 2 Com parison of the hepatic m itochond rial Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activity in the rats (μkat/g, ±s,n=6)

表2 各組大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比較(μkat/g，±s，n=6)Tab. 2 Com parison of the hepatic m itochond rial Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activity in the rats (μkat/g, ±s,n=6)

(1)P＜0.05 com pared with g roup A; (2)P＜0.05 com pared with g roup B; (3)P＜0.05 com pared with g roup C

Group Na+-K+-ATPase Ca2+-Mg2+-ATPase 1st w eek A 1.179±0.263 1.143±0.187 B 1.128±0.226 1.127±0.156 C 1.181±0.237 1.133±0.162 D 1.284±0.271 1.184±0.171 3rd w eek A 1.165±0.233 1.137±0.151 B 1.015±0.241(1) 1.017±0.161(1)C 1.251±0.219(2) 1.242±0.158(2)D 1.528±0.242(2)(3) 1.487±0.155(2)(3)5 th w eek A 1.183±0.257 0.148±0.164 B 0.915±0.227(1) 0.875±0.153(1)C 1.308±0.224(2) 1.327±0.160(2)D 1.631±0.257(2)(3) 1.592±0.151(2)(3)

3 討 論

線粒體是細(xì)胞有氧代謝的重要場(chǎng)所[9]，氧化磷酸化是機(jī)體內(nèi)重要的能量來(lái)源，由線粒體內(nèi)膜的呼吸鏈完成。線粒體氧化磷酸化的關(guān)鍵是線粒體內(nèi)膜功能及通透屏障的完整性[10-11]。Ca2+在調(diào)控線粒體功能及ATP合成過(guò)程中起著重要作用[12]，刺激氧化磷酸化是其最基本的功能之一。根據(jù)M ithell提出的化學(xué)滲透假說(shuō)，呼吸鏈位于線粒體內(nèi)膜的外側(cè)，當(dāng)H+在膜外側(cè)堆積時(shí)，會(huì)導(dǎo)致膜內(nèi)外的跨膜電位差，這是線粒體氧化磷酸化過(guò)程中發(fā)生的根本態(tài)勢(shì)。此種化學(xué)電位差被膜上的ATP酶有效利用，可以從Pi+ADP合成ATP。同時(shí)，化學(xué)電位差導(dǎo)致了線粒體Ca2+內(nèi)流，隨著Ca2+內(nèi)流增加，線粒體內(nèi)膜陽(yáng)離子凈增加，導(dǎo)致內(nèi)膜去極化，為了保持內(nèi)膜的去極化狀態(tài)，線粒體通過(guò)生物氧化以加快H+外排。Ca2+內(nèi)流可破壞線粒體生物氧化的過(guò)程，使機(jī)體合成ATP的能力下降。

目前有研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)可以提高線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性[4]。力竭運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致大鼠肝臟自由基產(chǎn)生增多，脂質(zhì)過(guò)氧化嚴(yán)重，肝臟MDA含量增加，酶的活性降低[13]。本研究結(jié)果表明，脈沖電流經(jīng)皮刺激運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠肝區(qū)可以提高肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，而線粒體Na+-K+-ATP酶的活性增高可減少線粒體水鈉潴留，減輕線粒體腫脹，此外，Na+-K+-ATP酶除了可維持跨膜的電化學(xué)鈉、鉀離子梯度以外，還可降低線粒體內(nèi)游離鈣濃度，減輕線粒體鈣超載[14]。

本課題組前期研究表明，脈沖電流經(jīng)皮刺激運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠肝區(qū)能夠降低肝組織Bax的表達(dá)，提高Bc l-2的表達(dá)，維護(hù)肝組織的正常結(jié)構(gòu)[13]。采用頻率為1024Hz的脈沖電流刺激(電流強(qiáng)度10m A，間動(dòng)周期1s)可加速乳酸代謝，提高運(yùn)動(dòng)耐力，減輕運(yùn)動(dòng)性疲勞導(dǎo)致的肝損傷[15-17]。本研究結(jié)果顯示，第3周末、第5周末D組大鼠游泳力竭時(shí)間均明顯長(zhǎng)于B組和C組(P＜0.05)，而B(niǎo)組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明脈沖電流經(jīng)皮刺激運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠肝區(qū)可以提高其運(yùn)動(dòng)耐力及運(yùn)動(dòng)成績(jī)。A組、C組及D組大鼠肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在第3、5周末均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明脈沖電流經(jīng)皮刺激運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠肝區(qū)可以提高其活性水平，增強(qiáng)線粒體氧化磷酸化，降低線粒體內(nèi)游離鈣濃度，從而緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞。

綜上所述，運(yùn)動(dòng)性疲勞可以降低肝臟線粒體Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，脈沖電流經(jīng)皮刺激運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠肝區(qū)可以提高其活性水平，降低線粒體內(nèi)游離鈣濃度，并減少線粒體鈣超載，刺激氧化磷酸化，提高運(yùn)動(dòng)耐力及運(yùn)動(dòng)成績(jī)，加速機(jī)體運(yùn)動(dòng)性疲勞的消除。此外，運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生及消除是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，盡管目前的研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，但對(duì)于肝臟線粒體與運(yùn)動(dòng)性疲勞之間的確切關(guān)系還需要進(jìn)一步深入探討。

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