彭曉琳，徐 健，郝麗萍，孫秀發(fā)，陳忠偉

(1 南山區(qū)慢性病防治院慢非科，深圳 518054;2深圳市慢性病防治中心，深圳 518020;3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，武漢 430030)

白藜蘆醇(resveratrol，Res)屬于非黃酮類多酚化合物，化學(xué)名稱為3，5，4'-三羥基二苯乙烯(3，5，4'-trihydroxystilbene)，又稱芪三酚。已有研究表明，白藜蘆醇具有抗癌、抗心血管疾病、抗突變、抗菌、抗炎、抗氧化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及雌激素調(diào)節(jié)等藥理活性［1］。植物化學(xué)物的生物利用度及其在體內(nèi)代謝、轉(zhuǎn)化等方面的研究是確定植物化學(xué)物生物效應(yīng)的重要基礎(chǔ)。目前，有關(guān)白藜蘆醇在動(dòng)物及人體內(nèi)的吸收和代謝的研究報(bào)道較少，因此，明確白藜蘆醇在體內(nèi)的吸收代謝情況是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。本研究利用高效液相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，系統(tǒng)地研究了大鼠灌飼白藜蘆醇后，白藜蘆醇在體內(nèi)的代謝情況，為深入探討其健康生物學(xué)效應(yīng)和制訂人體推薦攝入量奠定基礎(chǔ)，也為提高白藜蘆醇在體內(nèi)的生物利用度及應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 器材

Waters 1525 binary HPLC 色譜泵(美國(guó))及熒光檢測(cè)器;Hypersil C18(250mm ×4.6mm ×5μm)液相色譜柱及相同填充顆粒的C18保護(hù)柱;氣相色譜-質(zhì)譜(GCMS)聯(lián)用儀(Agilent GC HP 6890/MS HP 5975);SPE C18小柱，N2 吹干儀。

1.2 試劑

白藜蘆醇及白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma 公司):純度99%、四蒸水、乙酸乙酯(分析純)、乙醇(分析純)、甲酸(分析純)、正庚烷(分析純)、衍生化試劑BSTFA、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、冰乙酸(色譜純)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar 大鼠10 只，體重180～200 g (湖北省動(dòng)物中心提供)。實(shí)驗(yàn)前禁食10h，照常飲水。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度系列配制

準(zhǔn)確稱取白藜蘆醇及反式白藜蘆醇苷各2.0mg，置于15mL 真空離心管中，分別用10mL 甲醇溶解并充分混勻，制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后按1∶1 比例混勻，依次稀釋配制成10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)濃度系列。然后吸取該混合系列各濃度20μL按選定的HPLC 色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積積分值×105為橫坐標(biāo)(X)、混合標(biāo)準(zhǔn)液濃度為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 代謝學(xué)色譜條件

(1)HPLC 測(cè)定

色譜柱:美國(guó)Hypersil ODS-C18(4.6mm ×250mm，5μm);柱溫:35℃;流動(dòng)相A (甲醇:乙酸:水=10∶2∶88)、B (甲醇:乙酸:水=90∶2∶8);流速1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為λex=330nm、λem=374nm;進(jìn)樣量20μL;梯度洗脫:0min，85% A、15% B;5min，65%A、35% B;8min，65% A、35% B;15min，50% A、50%B;25min，30%A、70%B，待該梯度完成后間隔10min 后使系統(tǒng)回到初始狀態(tài)再繼續(xù)進(jìn)樣。

(2)GC-MS 測(cè)定

色譜條件:進(jìn)樣口溫度280℃，柱溫采用程序升溫，初溫100℃，保持2min 后，以10℃/min 速度升至300℃，恒溫 10min，載氣為純氦氣，流速為110mL/min。

質(zhì)譜條件:接口溫度280℃，El 離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，四極桿溫度106℃，電子倍增器電壓1 400V，質(zhì)量掃描范圍30～550。

1.4.3 動(dòng)物給藥方案

動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1w 后，分裝到10 個(gè)代謝籠中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前禁食12h，按50mg/(kg·bw)劑量灌胃給以白藜蘆醇。灌胃白藜蘆醇后0min、10min、30min、1h、3h、5h、7h、24h、48h 從大鼠內(nèi)眥靜脈取血，靜脈血樣置于含肝素鈉的抗凝管中，2 000g 離心10min，按1.4.1步驟處理待測(cè)。

1.4.4 品預(yù)處理

(1)血漿

100μL 血漿分別加入加100μL 甲酸水溶液(pH=3.5)和300μL 乙腈，漩渦震蕩1min，然后4 000g 離心10min，將上清轉(zhuǎn)入另一管中，40℃氮?dú)獯蹈?。再將殘?jiān)貞矣?00μL 流動(dòng)相中，取一定體積進(jìn)行HPLC 檢測(cè)。進(jìn)行GC-MS 分析時(shí)，則需進(jìn)行衍生化處理，在殘?jiān)屑尤胍欢w積2-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺(BSTFA)60℃處理30min 后待測(cè)。

(2)尿樣

將得到的鼠尿通過C18柱，然后用乙醇萃取，萃取液用N2吹干儀于45℃吹干。剩下的油性殘?jiān)芙庠诹鲃?dòng)相中待測(cè)。如是進(jìn)行GC-MS 分析，則需進(jìn)行衍生化，同前。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇與白藜蘆醇苷HPLC 圖譜

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品(A)及樣品(B)中白藜蘆醇及其苷類的HPLC 圖譜

2.2 HPLC 檢測(cè)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

如圖2 所示，以峰面積×105為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，白藜蘆醇及其糖基化物在0～10mg/L 濃度范圍內(nèi)線性較好，白藜蘆醇的回歸方程為y=0.050 7x－0.050 6 (R2=0.999 5)、白藜蘆醇苷的回歸方程為y=0.031 4x－0.076 8 (R2=0.999 6)。

圖2 白藜蘆醇及白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.2.2 白藜蘆醇代謝

(1)血漿HPLC 檢測(cè)

如圖3 所示，白藜蘆醇進(jìn)入體內(nèi)可迅速轉(zhuǎn)換為其糖基化衍生物，攝入后10min 血液中即可檢測(cè)到白藜蘆醇苷，濃度約為10mg/L，3h 后達(dá)到高峰，血液中可含23.78mg/L 糖基化苷，5h 后代謝趨緩，到24h 時(shí)幾乎代謝完畢;而白藜蘆醇則在攝入后1h 達(dá)到高峰，但其含量不到同時(shí)段內(nèi)其糖基化物的1/3，且在3h 后血漿中含量逐漸趨于零。

圖3 大鼠灌飼白藜蘆醇后血漿中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷濃度-時(shí)間效應(yīng)

(2)尿液HPLC 檢測(cè)

如圖4 所示，白藜蘆醇原型及其糖基化衍生物主要在白藜蘆醇攝入后24h 內(nèi)從尿液排泄。24h 內(nèi)約排出4.26mg 白藜蘆醇原型、0.32mg 白藜蘆醇糖基化衍生物。24～48h 之間僅排出白藜蘆醇原型物質(zhì)0.03mg、白藜蘆醇衍生化物約0.01mg。

圖4 大鼠灌飼白藜蘆醇后尿液中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷濃度-時(shí)間效應(yīng)

(3)血漿GC-MS 檢測(cè)

機(jī)體攝入白藜蘆醇1h 后，血漿中代謝產(chǎn)物明顯增加，3h 達(dá)到高峰，種類最多，含量也最高，與HPLC 法分析所得結(jié)果具有一致性。

3 討論

圖5 GC-MS 法分析不同時(shí)間血漿中白藜蘆醇及其代謝物情況

研究顯示，植物化學(xué)物的功效學(xué)是與其生物利用度及其在體內(nèi)的代謝途徑，代謝物的組織分布、轉(zhuǎn)化及排泄等方面密切相關(guān)的。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇攝入60min 后，血漿中白藜蘆醇原型即已出現(xiàn)峰值，但其含量不高;而白藜蘆醇糖基化衍生物3h 后才達(dá)到最高，其含量是前者的5 倍，說明白藜蘆醇口服攝入后，主要以糖基化形式進(jìn)入血漿進(jìn)行代謝。有研究者報(bào)道［2～5］，經(jīng)腹腔注射白藜蘆醇后不到10min，血漿中白藜蘆醇含量即消除了一半，4～8h 后血漿中白藜蘆醇濃度又急驟上升，發(fā)生了腸肝循環(huán)。本研究通過口服攝入白藜蘆醇則未觀察到這一現(xiàn)象，說明白藜蘆醇的攝入方式是影響其生物利用度的關(guān)鍵因素之一。通過氣質(zhì)聯(lián)用分析發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇經(jīng)口攝入3h 后，血漿中的代謝產(chǎn)物含量及種類均達(dá)到最多，這進(jìn)一步驗(yàn)證了白藜蘆醇在血漿中的代謝情況，如前述HPLC 分析結(jié)果所示，血漿中白藜蘆醇苷在白藜蘆醇攝入后3h 達(dá)到峰值，即白藜蘆醇進(jìn)入體內(nèi)后，主要以其各種代謝產(chǎn)物的形式存在。

本研究還發(fā)現(xiàn)，尿液中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量與血漿中完全相反，白藜蘆醇經(jīng)口攝入(約7～8g)24h后，大量白藜蘆醇原型可經(jīng)尿液排泄，累計(jì)排泄率超過攝入量的一半，而白藜蘆醇糖基化苷則僅有僅有白藜蘆醇原型水平的十幾分之一，不到總攝入量的4%。說明白藜蘆醇在體內(nèi)可能主要以糖基化物發(fā)揮生物學(xué)功效，白藜蘆醇原型在機(jī)體內(nèi)的生物利用率相對(duì)較小。研究證明，白藜蘆醇排泄與攝入的是純品還是食物也有關(guān)，飲用葡萄汁(主要為白藜蘆醇糖甙形式)后，白藜蘆醇的累積排泄量只有給予同樣劑量的純品的1/10［4］，說明白藜蘆醇的攝入形式會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生很大的影響，食物中因含有多種化合物可能會(huì)干預(yù)白藜蘆醇的吸收。

由此看來，在不同的種屬、不同的純度及食物來源等情況下，白藜蘆醇的代謝情況是存在明顯差異的，在進(jìn)行白藜蘆醇的某一特殊功效研究時(shí)，有必要根據(jù)具體的種屬及受試物來評(píng)價(jià)白藜蘆醇的這一生物學(xué)作用，這樣對(duì)其應(yīng)用于臨床及確定治療劑量具有重要的實(shí)踐意義。鑒于純品的吸收量和速度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過食物，如果白藜蘆醇對(duì)機(jī)體確實(shí)是有益而無害的，那么，食用白藜蘆醇保健品將是預(yù)防和治療血管性疾病的重要手段之一。

［1］余慧琳.白藜蘆醇的生理功能及其應(yīng)用前景［J］.生物學(xué)通報(bào)，2005，40(11):12-13.

［2］Juan M E，Alfaras I，Planas J M.Determination of dihydroresveratrol in rat plasma by HPLC ［J］.J Agric Food Chem，2010，58(12):7472-7475.

［3］Juan M E，Maijo M，Planas J M.Quantification of transresveratrol and its metabolites in rat plasma and tissues by HPLC ［J］.J Pharm Biomed Anal，2010，51(2):391-398.

［4］Wenzel E，Somoza V.Metabolism and bioavailability of trans-resveratrol ［J］.Mol Nutr Food Res，2005，49(5):472-481.

［5］Andriambeloson E，Kleschyov A L，Muller B，et al.Nitric oxide production and endothelium-dependent vasorelaxation induced by wine polyphenols in rat aorta ［J］.Br J Pharmacol，1997，120(6):1053-1058.