毛慶蓮 劉雪峰 董愛(ài)榮 宋慶超

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (大興安嶺地區(qū)塔河林業(yè)局繡峰林場(chǎng))

責(zé)任編輯:程 紅。

樺褐孔菌(Ⅰnonotus obliquus)屬真菌門(mén)(Eumycota)擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina)層菌綱(Hymenomycetes)非褶菌目(Aphyllophorales)多孔菌科(Polyporaceae)纖孔菌屬［1］，俗稱樺癌褐孔菌、白樺茸、斜管纖孔菌，歐洲人稱之為chaga［2］，是一種藥用價(jià)值很高、應(yīng)用前景廣泛的真菌，可用于治療各種消化道癌癥、降血糖、防治艾滋病、抗衰老、降血脂、降血壓，還能夠改善過(guò)敏體質(zhì)，增強(qiáng)免疫力［3］。樺褐孔菌主要寄生于白樺(Betula platyphylla)、銀樺(Grebillea robusta)、榆(Ulmus pumila)、赤楊(Alnus japonica)等落葉樹(shù)活立木的樹(shù)皮下或倒木枯干上，形成不育的木腐菌。其菌核可以在砍伐后的枯干上生存6年之久，菌絲體耐受低溫能力極強(qiáng)，主要分布于北緯45°～50°地區(qū)的苦寒地帶，如俄羅斯，中國(guó)黑龍江大小興安嶺、吉林省長(zhǎng)白山，北美北部及日本北海道［4-5］。由于樺褐孔菌生長(zhǎng)環(huán)境特殊，自然資源十分有限，子實(shí)體人工栽培困難，運(yùn)用發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)菌絲體，為研究和開(kāi)發(fā)樺褐孔菌食品、保健品和藥品提供充足的原材料具有重大的現(xiàn)實(shí)意義［6］。本研究對(duì)樺褐孔菌菌絲體液體培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)樺褐孔菌菌絲體提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

采自黑龍江省大興安嶺呼中國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)白樺林的野生樺褐孔菌子實(shí)體，采用傘菌分離法，分離獲得純菌種，根據(jù)子實(shí)體、菌絲體生長(zhǎng)特征，鑒定為樺褐孔菌。

1.2 菌絲體生物量的測(cè)定

將在PDA 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 的菌種用打孔器轉(zhuǎn)接至PDA 液體培養(yǎng)基里，裝液量250 mL 搖瓶裝100 mL 培養(yǎng)基，28 ℃、120 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d。搖培結(jié)束后將培養(yǎng)液離心取菌絲體，菌絲體經(jīng)去離子水水洗，再離心，這樣重復(fù)操作幾次，收集菌絲體，研磨過(guò)篩待測(cè)。

1.3 菌絲體多糖的測(cè)定

將干燥至質(zhì)量恒定的樺褐孔菌菌絲體，粉碎成粉末過(guò)60 目篩，取100 g 樣品用95%乙醇溶液回流提取3 h，濾液倒掉，重復(fù)提取3 次，除去樣品中的生物堿、色素、多酚類和低聚糖，棄濾液，烘干濾渣。處理后的濾渣按料液比1 ∶40 加水，待水浴鍋溫度升至45 ℃時(shí)，加入400 U·g-1纖維素酶和600 U·g-1中性蛋白酶，在功率125 W、溫度55 ℃的超聲提取器中作用2 h，升溫至80 ℃滅酶，并在此溫度條件下恒溫浸提3 h 后，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收，加95%乙醇溶液沉至乙醇終體積分?jǐn)?shù)80%，離心收集沉淀，用無(wú)水乙醇、乙醚、丙酮交替洗滌2 次，干燥得總多糖［7］。

1.4 單因素梯度法優(yōu)化液體培養(yǎng)條件

選用不同碳源、氮源、溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速，進(jìn)行單因素梯度試驗(yàn)，測(cè)定樺褐孔菌菌絲體生長(zhǎng)的情況，以菌絲體生物量和多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，優(yōu)化樺褐孔菌菌絲體培養(yǎng)條件。

碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，將碳源分別以25 g·L-1的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉5 個(gè)不同處理取代，其他條件不變，同一處理重復(fù)3 次，同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照，測(cè)定樺褐孔菌菌絲生物量和多糖產(chǎn)量。

氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，將氮源分別以15 g·L-1蛋白胨、酵母粉、豆餅粉、尿素、硫酸銨5 個(gè)不同處理取代，其他條件不變，同一處理重復(fù)3 次，同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照，測(cè)定樺褐孔菌菌絲生物量和多糖產(chǎn)量。

溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響:在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下，分別設(shè)定22、24、26、28、30、32 ℃這6 個(gè)梯度溫度處理，其他條件不變，同一處理重復(fù)3 次，同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照，測(cè)定樺褐孔菌菌絲生物量和多糖產(chǎn)量。

初始pH 值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響:在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下，分別設(shè)定5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5 這6 個(gè)梯度pH 處理，其他條件不變，同一處理重復(fù)3 次，同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照，測(cè)定樺褐孔菌菌絲生物量和多糖產(chǎn)量。

搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響:在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下，分別設(shè)定100、110、120、130、140、150 r·min-1這6 個(gè)梯度轉(zhuǎn)速處理，其他條件不變，同一處理重復(fù)3 次，同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照，測(cè)定樺褐孔菌菌絲生物量和多糖產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳碳源的確定

由表1可見(jiàn)，樺褐孔菌能利用供試的5 種碳源，以葡萄糖為碳源時(shí)，多糖產(chǎn)量最高，為37.42 mg/L，其次分別是蔗糖、玉米粉、麥芽糖等，而以玉米粉為碳源時(shí)，其菌絲生物量最高，為5.49 g/L，其次為葡萄糖(4.62 g·L-1)、蔗糖(4.35 g·L-1)。玉米粉作為價(jià)格低廉的農(nóng)副產(chǎn)品在應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)較為合適，但在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中其作為復(fù)雜的復(fù)合碳源會(huì)帶來(lái)其他影響。綜合考慮，選擇葡糖糖作為液體培養(yǎng)的最適碳源。

2.2 最佳氮源的確定

由表2可以看出，樺褐孔菌5 種氮源中均能生長(zhǎng)，但由于有機(jī)氮源富含各種可以被直接吸收的氨基酸，利于菌絲體生長(zhǎng)，故其對(duì)蛋白胨、酵母粉、豆餅粉的利用明顯好于尿素、硫酸銨等無(wú)機(jī)氮源。以蛋白胨為氮源時(shí)，多糖產(chǎn)量最高，為32.62 mg·L-1，此時(shí)菌絲生物量也最高，為4.45 g·L-1，其次分別為豆餅粉、酵母粉，同時(shí)蛋白胨可充當(dāng)生長(zhǎng)因子，縮短培養(yǎng)周期，故選擇蛋白胨作為最適氮源。

表1 碳源對(duì)樺褐孔菌多糖產(chǎn)量和菌絲生物量的影響

表2 氮源對(duì)樺褐孔菌多糖產(chǎn)量和菌絲生物量的影響

2.3 最適溫度的確定

由表3可見(jiàn)，樺褐孔菌在22～32 ℃均可以生長(zhǎng)。從22 ℃開(kāi)始菌絲生物量逐漸增加至28 ℃達(dá)到最大值(4.15 g·L-1)，而后隨溫度升高菌絲生物量明顯降低，而多糖產(chǎn)量則在26 ℃達(dá)到最高，為28.85 mg·L-1，隨后降低。綜合考慮多糖產(chǎn)量和菌絲生物量的指標(biāo)選擇27 ℃為最適培養(yǎng)溫度。

表3 溫度對(duì)樺褐孔菌多糖產(chǎn)量和菌絲生物量的影響

2.4 最適初始pH 值的確定

從表4可以得出，在設(shè)定的6 個(gè)梯度pH 范圍內(nèi)，樺褐孔菌菌絲體均可以生長(zhǎng)。當(dāng)pH 值為6.5時(shí)，菌絲生物量達(dá)到最高為3.84 g·L-1，隨著pH 繼續(xù)增加菌絲生物量下降，說(shuō)明接近自然pH 值比較適合菌絲體生長(zhǎng)。而多糖產(chǎn)量在pH 值小于8.5 時(shí)，隨其增加而增多，pH 值8.5 時(shí)達(dá)到最大，為24.11 mg·L-1，隨后再增加pH 值，多糖產(chǎn)量大幅度下降，說(shuō)明多糖的培養(yǎng)適合在中性偏堿條件下生長(zhǎng)。綜合考慮多糖產(chǎn)量和菌絲生物量標(biāo)準(zhǔn)，最終確定pH7.5為最適培養(yǎng)pH。

2.5 最適搖床轉(zhuǎn)速的確定

由表5可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速在100～130 r·min-1，菌絲生物量隨轉(zhuǎn)速增加而增加，130 r·min-1時(shí)菌絲生物量達(dá)到最大值(3.66 g·L-1)，而此時(shí)多糖產(chǎn)量也達(dá)到最高(22.89 mg·L-1)，繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速，菌絲生物量與多糖產(chǎn)量同時(shí)緩慢降低。故確定最適搖床轉(zhuǎn)速為130 r·min-1。

表4 pH 對(duì)樺褐孔菌多糖產(chǎn)量和菌絲生物量的影響

表5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)樺褐孔菌多糖產(chǎn)量和菌絲生物量的影響

3 結(jié)束語(yǔ)

以真菌多糖產(chǎn)量和菌絲生物量為指標(biāo)，應(yīng)用單因素梯度法確定了樺褐孔菌液體培養(yǎng)條件:最佳碳源是葡萄糖、最佳氮源為蛋白胨、最適培養(yǎng)溫度27 ℃、最佳初始pH7.5、最適宜搖培轉(zhuǎn)速130 r·min-1。本研究結(jié)果比較準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值，可為進(jìn)一步規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)樺褐孔菌菌絲體提供技術(shù)依據(jù)。

［1］ 林碧賢，李曄，毛景華，等.藥用真菌白樺茸:樺褐孔菌［J］.海峽藥學(xué)，2004，16(6):74-76.

［2］ 卯曉嵐.中國(guó)大型真菌資源及其評(píng)價(jià)［J］.西北植物學(xué)報(bào)，1989，9(1):52-61.

［3］ 黃年來(lái).俄羅斯神秘的民間藥用真菌:樺褐孔菌［J］.中國(guó)食用菌，2002，21(4):7-8.

［4］ 梁清樂(lè)，王秋穎，樊錦燕，等.樺褐孔菌的研究概況［J］.中草藥，2005，36(4):623-625.

［5］ 陳體強(qiáng)，吳錦忠.珍稀藥用菌:樺褐孔菌的研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2005，17(2):1-3.

［6］ 申進(jìn)文，李燕，王振河，等.樺褐孔菌液體深層發(fā)酵條件優(yōu)化研究［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(8):88-92.

［7］ 胡濤，解洛香，徐樂(lè)，等.超聲波輔助提取樺褐孔菌子實(shí)體中多糖和三萜［J］.食品科技，2012，37(2):213-217.