α7nAChR在氯化甲基汞神經(jīng)毒性中的作用

崔靜, 楊生森, 魯植艷, 楊維財(cái)， 田建英,*

1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004 2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，銀川 750004 3. 武漢大學(xué)中南醫(yī)院放射科，武漢 430072

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α7nAChR在氯化甲基汞神經(jīng)毒性中的作用

崔靜1, 楊生森2, 魯植艷3, 楊維財(cái)1， 田建英1,*

1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004 2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，銀川 750004 3. 武漢大學(xué)中南醫(yī)院放射科，武漢 430072

為探討環(huán)境染污染物氯化甲基汞(methylmercury chloride，MeHgCl)的神經(jīng)毒性作用機(jī)制，采用MTT、免疫細(xì)胞熒光、dot Blot、qRT-PCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)MeHgCl對(duì)PC12細(xì)胞活性及其α7亞型煙堿型膽堿能受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7nAChR)蛋白和mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示MeHgCl抑制PC12細(xì)胞活性，顯著降低α7nAChR的蛋白和mRNA的表達(dá)水平，呈濃度依賴性。上述結(jié)果表明,MeHgCl對(duì)神經(jīng)細(xì)胞毒性作用可能與抑制α7nAChR表達(dá)有關(guān)。

氯化甲基汞；α7nAChR；記憶；神經(jīng)毒性

汞是繼砷和鉛之后排名第三的環(huán)境毒物。一般人群汞暴露主要源于淡水魚(yú)和深海魚(yú)、牙科用汞合金材料和含硫柳汞的疫苗等。甲基汞是汞的毒性最強(qiáng)的形式，吸收后分布于人體所有器官和組織，包括腦和胎盤(pán)。體內(nèi)外研究表明，汞具有顯著的神經(jīng)毒性，可以引起神經(jīng)元丟失，破壞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能完整性，造成記憶和認(rèn)知功能障礙[1]，但其神經(jīng)細(xì)胞毒性機(jī)制尚不清楚。

煙堿型膽堿能受體(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR) 廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，α7 nAChR是其中較為特殊的亞型，能激活神經(jīng)元上的α7nAChR可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)釋放[2]、改變突觸可塑性[3]、幫助神經(jīng)元抵御內(nèi)外因素的損傷，維持正常的生理功能狀態(tài)，對(duì)維持記憶和認(rèn)知功能的十分重要。研究表明，α7 nAChR對(duì)改善阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease，AD)和精神分裂癥患者的認(rèn)知障礙有顯著作用[4]。本研究擬探討α7nAChR在汞的神經(jīng)毒性作用機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞(上海神經(jīng)科學(xué)研究所), 噻唑藍(lán) (MTT)、二甲基亞砜 (DMSO) (Sigma公司)，MeHgCl (Dr. Ehrenstorfer公司，純度97%)α7nAchR兔多克隆抗體 (Santa Cruz公司)，胰蛋白酶、PBS、DMEM/F12、青霉素/鏈霉素(Hyclone公司)，新生牛血清(四季青公司)，TRITC(中杉金橋)，Hoechst 33342(碧云天公司)。全蛋白提取試劑盒和BSA蛋白定量試劑盒(南京凱基公司)，總RNA提取試劑盒(Omega公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher公司)，熒光定量試劑盒(Takara公司)。

iMark酶標(biāo)儀(BIO-RAD，美國(guó))、NanoDrop 2000c 分光光度計(jì)(Thermo Fisher，美國(guó))、CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀(BIO-RAD，美國(guó))，BX51熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

觀察MeHgCl對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響，隨機(jī)分為對(duì)照組(0 μmol·L-1)MeHgCl組，1～4 μmol·L-1MeHgCl組，并觀察MeHgCl處理后對(duì)PC12細(xì)胞分子水平改變。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞于含15%新生牛血清、1%青霉素/鏈霉素的 DMEM/F12 1:1中培養(yǎng)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分別接種于 96 孔板和24孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.2.3 MTT法檢測(cè)PC12細(xì)胞活性

上述各組細(xì)胞在96孔板培養(yǎng)24 h后，移除培養(yǎng)基，每孔加入90 mL DMEM/F12培養(yǎng)基和10 μL MTT (5 mg·mL-1)，繼續(xù)孵育4 h, 加入 150 μL的DMSO，振搖10 min，于酶標(biāo)儀讀取OD值,檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm, 分析。

1.2.4 免疫細(xì)胞熒光法檢測(cè)α7nAchR亞單位蛋白水平

取各組細(xì)胞以 4%的多聚甲醛固定, PBS振洗, 10%山羊血清室溫封閉1 h, 加一抗 (1∶100稀釋)，4 ℃孵育48 h; 移除一抗，加TRITC二抗, 37 ℃、1 h, 加Hoechst 33342，37 ℃、10 min。PBS洗3次，每次5 min，抗淬滅封片劑封片。

1.2.5 BCA蛋白檢測(cè)法進(jìn)行蛋白定量

全蛋白提取試劑盒制備蛋白樣品，取不同濃度BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品分別加入96孔板，37 ℃溫箱孵育30 min，于酶標(biāo)儀570 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)量OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白樣品含量。

1.2.6 Dot-Blot檢測(cè)α7nAChR蛋白水平

取定量后的等量蛋白樣品點(diǎn)膜。TBST洗膜，脫脂奶粉封閉，將膜浸入一抗(1：200), 4 ℃孵育48 h，洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，DAB顯色10 min，自然晾干，掃描后進(jìn)行灰度分析。

1.2.7 qRT-PCR檢測(cè)α7nAChR mRNA水平

總RNA提取試劑盒提取總mRNA，測(cè)A值計(jì)算RNA純度。逆轉(zhuǎn)錄后，取cDNA做qPCR，qPCR所用引物(見(jiàn)表1)，由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。反應(yīng)條件為：qPCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 sec，95 ℃ 5 sec, 60 ℃ 30 sec，39個(gè)循環(huán)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，結(jié)果以2-ΔΔCt的形式表達(dá)，Ct為循環(huán)閾值。

表1 基因引物設(shè)計(jì)

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果(Results)

2.1 MTT法檢測(cè)MeHgCl對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響

MTT分析結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，MeHgCl處理組PC12細(xì)胞活性隨濃度遞增而降低，在MeHgCl 1 μmol·L-1組(0.4927±0.0204) PC12細(xì)胞活性與對(duì)照組相比變化不明顯94.33%(P>0.05)，在2～4 μmol·L-1組細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞活性分別為對(duì)照組的87.57% (P<0.01) 和66.72% 、25.71% (P<0.001)(見(jiàn)圖1)。

2.2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定MeHgCl對(duì)PC12細(xì)胞α7 nAchR蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞輪廓清楚，胞體呈梭形，突起細(xì)長(zhǎng)；MeHgCl處理組隨MeHgCl濃度增高，α7 nAchR的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞突起縮短，高濃度組甚至斷裂或消失，胞體變圓，細(xì)胞輪廓不清。MeHgCl組α7 nAchR陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯減弱，平均光密度(average optical density, AOD)減小(P<0.05)(見(jiàn)表2，圖2)。

圖1 不同濃度MeHgCl對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響Fig. 1 Effect of MeHgCl on cell viability(n=5,**P<0.01,***P<0.001vs control group)

圖2 不同濃度MeHgCl對(duì)PC12細(xì)胞α7nAChR 陽(yáng)性表達(dá)的影響注：A. 對(duì)照組(0 μmol·L-1)、B. MeHgCl 1 μmol·L-1組、C. MeHgCl 2 μmol·L-1、D. MeHgCl3μmol·L-1組，標(biāo)尺：50 μmFig. 2 Effect of MeHgCl on positive expression of α7nAChR in PC12 cellsNote: A. control group (0 μmol·L-1), B. MeHgCl 1 μmol·L-1, C. MeHgCl 2 μmol·L-1, D. MeHgCl3μmol·L-1, bar: 50 μm

表2 不同濃度MeHgCl對(duì)PC12細(xì)胞α7nAChR 陽(yáng)性表達(dá)的影響

Table 2 Effect of MeHgCl on positive expression of α7nAChR(n=4,x±s)

表2 不同濃度MeHgCl對(duì)PC12細(xì)胞α7nAChR 陽(yáng)性表達(dá)的影響

MeHgCl/(μmol·L-1)AOD(IOD/area)00．04173±0．0040410．03998±0．0007420．03614±0．00319?30．03380±0．00521?

注：*P<0.05與對(duì)照組(0 μmol·L-1)比較，IOD是積分光密度。

Note:*P<0.05vscontrol group (0 μmol·L-1), IOD is integration of optical density.

2.3 Dot-Blot測(cè)定MeHgCl對(duì)PC12細(xì)胞α7 nAchR蛋白水平的影響

Dot-Blot斑點(diǎn)試驗(yàn)觀察各組PC12細(xì)胞α7 nAchR蛋白的變化。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較， MeHgCl不同濃度組PC12細(xì)胞α7 nAchR蛋白水平均有明顯下降，并呈濃度依賴性遞減(見(jiàn)表3，圖3)。

表3 不同濃度MeHgCl對(duì)PC12細(xì)胞α7nAChR蛋白水平的影響

MeHgCl/(μmol·L-1) α7nAChR00．2228±0．018210．1652±0．0066???20．1217±0．0035???30．1060±0．0071???

注：***P <0.001與對(duì)照組(0 μmol·L-1)比較

Note:***P <0.001vscontrol group (0 μmol·L-1)

圖3 不同濃度MeHgCl對(duì)PC12細(xì)胞α7nAChR蛋白表達(dá)的影響(μmol·L-1)Fig. 3 Effect of MeHgCl on protein level of α7nAChR(n=3,***P <0.001vs control group)

2.4 qRT-PCR測(cè)定MeHgCl對(duì)PC12細(xì)胞α7 nAchR mRNA水平的影響(2-ΔΔCt)

qRT-PCR方法，觀察α7 nAchR mRNA水平的變化。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，MeHgCl (1～3 μmol·L-1)對(duì)PC12細(xì)胞α7 nAchR mRNA水平均有顯著抑制作用 (P <0.001) (見(jiàn)圖4)。

圖4 不同濃度MeHgCl對(duì)PC12細(xì)胞α7nAChR mRNA水平的影響Fig. 4 Effect of MeHgCl on mRNA level of α7nAChR(n=3,***P<0.001vs control group)

3 討論(Discussion)

有機(jī)汞在環(huán)境中具有分布廣、生物蓄積性高和神經(jīng)毒性強(qiáng)等特征。

不論是動(dòng)物，還是人體，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是有機(jī)汞毒性最敏感的部位。甲基汞容易跨過(guò)血腦屏障，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和細(xì)胞毒性[5]，靶向殺死神經(jīng)系統(tǒng)中視覺(jué)皮層、小腦、背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)的神經(jīng)元。環(huán)境污染水平的甲基汞暴露誘發(fā)海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡，造成不可修復(fù)的細(xì)胞缺陷，導(dǎo)致青春期海馬依賴性功能障礙[1]。定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明汞通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，細(xì)胞骨架組裝功能障礙和代謝障礙引起神經(jīng)毒性[6]。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，pmol·L-1濃度的MeHgCl可致海馬干細(xì)胞活性降低，且抑制其向神經(jīng)元分化[7]。本研究MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨MeHgCl濃度增高，PC12細(xì)胞線粒體還原酶活性逐漸下降，細(xì)胞存活率降低，存在濃度依賴性，表明甲基汞通過(guò)誘導(dǎo)自由基產(chǎn)生、氧化應(yīng)激，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞線粒體活性的下降，細(xì)胞死亡。神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，是有機(jī)汞引起神經(jīng)功能障礙的重要原因。

α7nAChR在海馬和皮層神經(jīng)元中高表達(dá)[8]，是膽堿能神經(jīng)元表達(dá)nAChR的主要亞型之一。配體門(mén)控型離子通道α7nAChR對(duì)Ca2+通透性極強(qiáng)，維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性[2]，改變突觸信號(hào)傳遞效率[9-10]。α7nAChR的缺損是膽堿能神經(jīng)元退化的關(guān)鍵因素。海馬是人和嚙齒類動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶功能形成的基礎(chǔ)。α7nAChR膽堿能神經(jīng)元丟失是AD等神經(jīng)退行性疾病認(rèn)知功能障礙的重要病理基礎(chǔ)[11]。AD患者皮質(zhì)和海馬α7nAChR表達(dá)水平顯著低于一般人群，激活α7nAChR可以保護(hù)膽堿能神經(jīng)元，改善記憶和認(rèn)知[4]。另外，激活α7nAChR抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和小鼠原代皮層神經(jīng)元的自噬活動(dòng)，降低Aβ的神經(jīng)毒性[12]。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)歸芍藥散腦脊液通過(guò)α7nAChR降低PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡[13-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度1 μmol·L-1MeHgCl處理24 h無(wú)明顯細(xì)胞活性變化，但α7nAChR mRNA和蛋白水平已顯著低于正常對(duì)照組，顯示α7nAChR在基因和蛋白水平對(duì)MeHgCl的毒性均十分敏感，表明α7nAChR生物合成降低先于細(xì)胞凋亡。

國(guó)際上研究表明α7nAChR亞型在認(rèn)知功能缺失以及AD的病理過(guò)程中有舉足輕重的作用。本研究證實(shí)α7nAChR亞型介導(dǎo)MeHgCl誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用。鑒于α7nAChR在認(rèn)知功能、感覺(jué)處理、情緒調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)作用中起關(guān)鍵作用。MeHgCl抑制中樞神經(jīng)元α7nAChR的表達(dá)可能是其導(dǎo)致記憶和認(rèn)知功能障礙的病理機(jī)制之一。

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◆

The Effects of α7nAChR on the Neurotoxicity of Methylmercury Chloride

Cui Jing1, Yang Shengsen2, Lu Zhiyan3, Yang Weicai1and Tian Jianying1,*

1. Ningxia Medical University School of Basic Medical Sciences, Yinchuan 750004, China 2. Department of Orthopedics, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China 3. Department of Radiology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430072, China

Received 12 January 2015 accepted 29 March 2015

To investigate the neurotoxicity of environmental pollutant, methylmercury chloride (MeHgCl) on the nervous system, the PC 12 cell viability was detected by MTT assay. The gene expression level of α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7nAChR, was evaluated by immunofluorescence, Dot-Blot and qRT-PCR both at protein and mRNA levels when PC12 cells were treated with MeHgCl. The results demonstrated that MeHgCl impaired the cell viability and inhibited α7nAChR gene expression both in transcriptional and translational levels in a dose-dependent manner. These results illustrated that the neurotoxicity of MeHgCl might be associated with the inhibition of α7nAChR gene expression.

MeHgCl; α7nAChR; memory; neurotoxicity

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No.81060231,81160338)；寧夏高校重點(diǎn)項(xiàng)目(NGY2011039) ；湖北省自然科學(xué)基金(No. 2013CFB277)

崔靜(1987-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境因素與老年性癡呆的發(fā)病機(jī)制及防治，E-mail: 15109685679@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: jianyingt@hotmail.com

10.7524/AJE.1673-5897-20150112001

2015-01-12 錄用日期：2015-03-29

1673-5897(2015)3-276-05

X171.5

A

田建英，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向環(huán)境因素與老年性癡呆的發(fā)病機(jī)制及防治。

崔靜，楊生森，魯植艷, 等. α7nAChR在氯化甲基汞神經(jīng)毒性中的作用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015, 10(3): 276-280

Cui J, Yang S S, Lu Z Y, et al. The effects of α7nAChR on the neurotoxicity of methylmercury chloride [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 276-280 (in Chinese)