脊尾白蝦蛻皮抑制激素基因全長cDNA的克隆及其對環(huán)境脅迫的響應(yīng)*

張 美 劉 萍① 李吉濤 李 健

(1. 大連海洋大學(xué) 大連 116023; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)又名白蝦、五須蝦、小白蝦、迎春蝦等,隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、游泳亞目(Natantia)、長臂蝦科(Palaemonidae)、長臂蝦屬(Palaemon)、白蝦亞屬(Exopalaemon)(劉瑞玉,1995),產(chǎn)量僅次于中國毛蝦(Acetes chinensis)和中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)。脊尾白蝦具有肉質(zhì)細(xì)嫩、繁殖能力強(qiáng)、生長速度快、環(huán)境適應(yīng)性廣和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn),是我國特有的小型經(jīng)濟(jì)蝦類之一。近年來,作為沿海灘涂地區(qū)重要的特色水產(chǎn)品,脊尾白蝦繁育和養(yǎng)殖技術(shù)日漸成熟。梁俊平等(2012a)研究了脊尾白蝦全人工繁育技術(shù),明確了胚胎發(fā)育、幼體孵化的適宜溫度和鹽度范圍; 栗治國等(2013)對胚胎發(fā)育、幼體發(fā)育及其主要環(huán)境影響因素也進(jìn)行了探討。在脊尾白蝦疾病防治方面,許文軍等(2010)對池塘養(yǎng)殖脊尾白蝦感染血卵渦鞭蟲進(jìn)行了系統(tǒng)的病原學(xué)研究; 沈輝等(2013)研究了白斑綜合征病毒對脊尾白蝦的致病性。在脊尾白蝦免疫等功能基因方面,段亞飛等(2013)首次構(gòu)建了血細(xì)胞cDNA文庫,克隆了組織蛋白酶L、谷胱甘肽過氧化物酶和組織蛋白酶D等基因,并分析了這些基因在機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)中的作用; 李美玉等(2012)克隆了鐵蛋白基因,并分析了 WSSV攻毒刺激后其在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化。而關(guān)于環(huán)境脅迫方面的研究也有報(bào)道,韓俊英等(2011)克隆得到熱休克蛋白HSP70基因,分析了其在溫度、pH值和氨氮脅迫下的響應(yīng); 李洋等(2013,2014)克隆了酚氧化酶原基因和絲氨酸蛋白酶抑制劑基因,分析了鹽度脅迫后其在肝胰腺和血細(xì)胞組織中的表達(dá)變化規(guī)律; 梁俊平等(2012b)確定了脊尾白蝦的氨氮耐受范圍,任海等(2014)研究了急性氨氮脅迫對脊尾白蝦抗氧化系統(tǒng)酶活力及GPx基因表達(dá)的影響。

甲殼動(dòng)物蛻皮抑制激素(molt-inhibiting hormone,MIH)屬于高血糖激素家族基因,在甲殼動(dòng)物的生長、繁殖、蛻皮和滲透壓調(diào)節(jié)等一系列活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。MIH通過調(diào)控蛻皮激素的分泌來抑制蛻皮過程,蛻皮激素控制蛻皮過程的發(fā)生,由此可見蛻皮過程主要是由蛻皮抑制激素和蛻皮激素相互拮抗進(jìn)行調(diào)控。目前 MIH基因在鷹爪蝦(Trachypenaeus curvirostris)(王在照等,2002)、刀額新對蝦(Metapenaeus ensis)(Tiuet al,2007)、中國對蝦(王在照等,2003)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)(Sun,1994)、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)(Linet al,1998)、日本囊對蝦(Penaeus japonicus)(Ohiraet al,1997)等蝦類中已見相關(guān)報(bào)道,且發(fā)現(xiàn)在蛻皮調(diào)控研究中發(fā)揮了重要作用。近年來,隨著脊尾白蝦養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴(kuò)大及生態(tài)環(huán)境的不斷惡化,由病毒和細(xì)菌引發(fā)的蝦類疾病頻繁發(fā)生,嚴(yán)重影響了蝦類養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展,造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。甲殼動(dòng)物有復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng),能快速地啟動(dòng)調(diào)控因子,直接或間接地應(yīng)對外部因素的刺激。這些外部因素包括溫度、鹽度、光照周期性、營養(yǎng)和壓力等。Lorenzon等(2000)發(fā)現(xiàn),重金屬Hg、Cd脅迫下巖蝦(Palaemon elegans)體內(nèi)高血糖激素(hyperglycemic hormone,CHH)表達(dá)量在2h之內(nèi)出現(xiàn)升高。Sedlmeier(1988)揭示,低鹽度下 CHH能促使淡水螯蝦的滲透壓上升。Santos等(1993)發(fā)現(xiàn),注射葡萄糖后 CHH 和乳酸的水平顯著降低,注射乳酸后 CHH和葡萄糖升高,注射任何氨基酸對蟹血淋巴中的 CHH葡萄糖和乳酸無任何影響。Stentiford等(2001)研究發(fā)現(xiàn),感染血卵渦鞭蟲的挪威海螯蝦(Nephropsnorvegicus)血淋巴中CHH含量上升。Webster(1996)發(fā)現(xiàn)普通黃道蟹(Cancer pagurus)組織缺氧導(dǎo)致CHH表達(dá)量明顯增加。而MIH的表達(dá)水平與外界環(huán)境脅迫的關(guān)系僅有少量報(bào)道,Chang等(1990)報(bào)道,MIH在美洲海螯蝦(Homarus americanu)中具有顯著的高血糖活性。Lago-Lestón等(2007)研究了溫度和鹽度對凡納濱對蝦幼蝦CHH和MIH表達(dá)的影響。目前為止,EcMIH基因表達(dá)與pH、氨氮脅迫的關(guān)系尚未見報(bào)道。

本研究采用同源克隆方法獲得脊尾白蝦 MIH-like基因全長cDNA序列,分析了脊尾白蝦在pH、氨氮、鹽度脅迫后其眼柄和腹神經(jīng)節(jié)中該基因的表達(dá)變化規(guī)律,研究結(jié)果對于解釋脊尾白蝦的環(huán)境適應(yīng)性及其健康養(yǎng)殖具有重要的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用蝦 本實(shí)驗(yàn)用健康脊尾白蝦均為同一家系蛻皮間期,2013年9月取自山東昌邑海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司,體長(4.10±0.30)cm,體重(1.10±0.30)g。放在200L PVC桶中暫養(yǎng)一周,期間每日換水1/3。投喂消毒處理后的沙蠶。之后進(jìn)行為期 5天的環(huán)境脅迫實(shí)驗(yàn),期間不投餌也不換水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材 TRIzol Reagent、FS Universal SYBR Green Master (ROX)購自Roche公司;LATaq試劑盒、PrimeScripTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、PMD18-T載體均購自 TaKaRa公司;SMARTTMRACE Amplification Kit購自Clontech公司;大腸桿菌 Top10感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生化科技有限公司; DNA膠回收試劑盒購自上海生工公司; 其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 脊尾白蝦眼柄總RNA提取

取 4尾去眼球及眼球內(nèi)黑色素的健康脊尾白蝦眼柄,只留柄部供總 RNA的提取。提取方法按照羅氏說明書進(jìn)行。用快速核酸/蛋白分析儀對總RNA進(jìn)行定性和定量檢測。紫外分光光度計(jì)和 1.0%的 TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量和完整性。

1.3 脊尾白蝦EcMIH基因cDNA中間片段克隆

參考GenBank公布的中國對蝦(AF312977.4)、羅氏沼蝦(KC990939.1)、凡納濱對蝦(DQ412566.1)日本囊對蝦(AB162448.1)、刀額新對蝦(AB162448.1)、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)(AY496454.1)MIH基因的cDNA編碼區(qū),利用DNAMAN軟件根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)一對簡并引物FM1和RM1(表1)。

以脊尾白蝦眼柄cDNA為模板,利用設(shè)計(jì)好的簡并引物克隆出脊尾白蝦EcMIH基因的中間序列。PCR反應(yīng)程序: 94°C 5min; 94°C 30s,57°C 30s,72°C 30s,30個(gè)循環(huán); 72°C 10min。將PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司測序,得到脊尾白蝦 MIH基因中間目的片段206bp。

1.4 脊尾白蝦EcMIH基因全長cDNA的克隆

根據(jù)已獲得脊尾白蝦EcMIH基因cDNA中間序列設(shè)計(jì) 3'RACE和 5'RACE特異性引物。MspF1、MspF2、MspR1和MspR2,然后再根據(jù)獲得3'RACE和 5'RACE部分序列設(shè)計(jì)特異性引物 MspF3和MspR3(表 1)。用 SMART?RACE Amplification Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

表1 引物名稱和序列Tab.1 Names and sequences of the primers

以脊尾白蝦眼柄第一鏈cDNA為模板,利用LA Taq (TaKaRa)試劑盒進(jìn)行3'RACE、5'RACE擴(kuò)增。第一次擴(kuò)增反應(yīng)體系為: 模板cDNA 0.2μL; TaKaRa LA Taq (5U/μL) 0.1μL; 10×LA PCR Buffer 1μL; dNTP mixture (各 2.5mm) 1.6μL; 引物各 0.2μL; 滅菌水6.7μL。第二次擴(kuò)增反應(yīng)體系為: 引物各 0.2μL;TaKaRa LA Taq (5U/μL) 0.1μL; 第一次 PCR 產(chǎn)物0.5μL; 10×LA PCR Buffer 1μL; dNTP mixture (各2.5mm) 1.6μL; 滅菌水 6.4μL。3'RACE 第一次擴(kuò)增用引物 MspF1和通用引物 UPM,第二次擴(kuò)增用引物MspF2、MspF3和通用引物NUP。5'RACE第一次擴(kuò)增用引物MspR1和通用引物UPM,第二次擴(kuò)增用引物 MspR2、MspR3和通用引物 NUP。反應(yīng)程序?yàn)?94°C 4min; 94°C 30s,57°C 30s,72°C 2min,30 個(gè)循環(huán);72°C 10min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用 DNA膠回收試劑盒切膠回收目的片段,純化并檢測。膠回收產(chǎn)物與PMD18-T載體相連接。5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到50μLE.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性克隆進(jìn)行菌落 PCR鑒定。鑒定結(jié)果送與上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.5 序列分析

利用NCBI中的 VecScreen去除載體序列,再用BLAST進(jìn)行序列比對,用 ContigExpress 軟件將 5'端序列、中間片段、3'端序列進(jìn)行拼接。使用BLAST對獲得的 MIH基因序列以及推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對。然后用EditSeq程序搜尋開放閱讀框(ORF)并將其翻譯成氨基酸。利用 SMART軟件進(jìn)行功能域預(yù)測。用DNAMAN軟件對脊尾白蝦MIH-like基因與其它物種的MIH氨基酸序列進(jìn)行多序列比對,采用 MAGE4.0軟件中的鄰接法(Neighbour-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 脅迫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6.1 pH 根據(jù)于天基等(2014)報(bào)道的脊尾白蝦半致死pH值的測定。設(shè)定本實(shí)驗(yàn)的pH值脅迫組3個(gè),pH值分別為6.5(低pH值脅迫組)、8.0(對照組)、9.5(高pH值脅迫組)。脅迫組所用海水使用25%NaOH和鹽酸調(diào)節(jié)養(yǎng)殖用水的pH值,實(shí)驗(yàn)期間各處理組pH值的變動(dòng)幅度為±0.1。pH值每4h調(diào)整一次。每組設(shè)3個(gè)平行,每個(gè)平行36尾蝦。實(shí)驗(yàn)期間分別于0、3、6、12、24、48、72、96h,從實(shí)驗(yàn)桶中隨機(jī)挑選4尾蝦,取其眼柄和腹神經(jīng)節(jié),保存于液氮中。實(shí)驗(yàn)期間海水溫度為18°C,鹽度為32。

1.6.2 鹽度脅迫實(shí)驗(yàn) 根據(jù)劉海(2005)報(bào)道的脊尾白蝦在不同鹽度水體中適應(yīng)性試驗(yàn)。設(shè)計(jì)7個(gè)鹽度梯度,分別為 4、11、18、25、32、39、46,鹽度 32為自然海水對照組。其它鹽度組用淡水和海鹽調(diào)節(jié),每組設(shè) 3個(gè)平行,每個(gè)平行 36尾蝦。實(shí)驗(yàn)期間分別于0、3、6、12、24、48、72、96h,從實(shí)驗(yàn)桶中隨機(jī)挑選4尾蝦,取其眼柄和腹神經(jīng)節(jié),保存于液氮中。實(shí)驗(yàn)期間海水溫度為18°C,pH值為7.8±0.2。

1.6.3 氨氮實(shí)驗(yàn) 根據(jù) Chen等(1988)和鐘碩良等(1997)測定的養(yǎng)殖池塘底層海水的氨氮濃度為0—46mg/L和0.01—29.3mg/L,以及梁俊平(2012b)報(bào)道的脊尾白蝦成蝦 72h半致死質(zhì)量氨氮濃度(140.28mg/L),設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)的 5個(gè)氨氮梯度,分別為0mg/L(對照)、2mg/L(低濃度)、4mg/L(中濃度)、6mg/L(中高濃度)和8mg/L(高濃度),每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行,每個(gè)平行36尾蝦。使用20g/L的氯化銨調(diào)整不同實(shí)驗(yàn)組的氨氮濃度,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣的同時(shí)采集水樣,奈氏試劑法(陳佳蓉,1996)測定水體的總氨氮濃度并測定水體的pH值、溫度和鹽度。根據(jù)Bower and Bidwell方程計(jì)算水體中NH3的濃度。實(shí)驗(yàn)期間分別于 0、3、6、12、24、48、72、96h,從實(shí)驗(yàn)桶中隨機(jī)挑選4尾脊尾白蝦,取其眼柄和腹神經(jīng)節(jié),保存于液氮中。實(shí)驗(yàn)期間海水溫度為18°C,鹽度為32,pH值為7.8±0.2。此外,為了檢測脊尾白蝦EcMIH基因在不同組織中的表達(dá)水平,另取 12尾健康脊尾白蝦的眼柄、腹神經(jīng)節(jié)、心臟、血細(xì)胞、鰓、肝胰腺、肌肉、卵巢、腸、胃等組織,用于 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.7 脊尾白蝦EcMIH基因的表達(dá)分析

Trizol試劑提取各實(shí)驗(yàn)組脊尾白蝦眼柄和腹神經(jīng)節(jié)等組織的總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,方法按韓俊英等(2011)進(jìn)行。以 EcMIH基因的 cDNA序列為模板,設(shè)計(jì)熒光定量引物MspF4和 MspR4(表 1),根據(jù)GenBank中脊尾白蝦的 β-actin基因序列設(shè)計(jì)一對內(nèi)參引物β-actin-F、β-actin-R(表1),并檢測熒光定量引物及內(nèi)參引物的特異性,結(jié)果顯示良好。利用Real-time PCR檢測pH、鹽度、氨氮脅迫后的脊尾白蝦眼柄和腹神經(jīng)節(jié)中不同時(shí)間點(diǎn) MIH基因的相對表達(dá)量。反應(yīng)體系和程序參考FS Universal SYBR Green Master (ROX)說明書,采用 10μL 反應(yīng)體系,包括正反向引物各 0.1μL; 5μL FS Universal SYBR Green Master (ROX); 1.0μL cDNA; 3.8μL DEPC 水。反應(yīng)程序?yàn)? 95°C 10min; 95°C 10s,60°C 34s,40 個(gè)循環(huán);95°C 15s,60°C 1min,95°C 15s。實(shí)驗(yàn)中每 4 尾混合作為一個(gè)樣品,數(shù)據(jù)為 3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,采用2-△△CT法計(jì)算脊尾白蝦EcMIH基因的相對表達(dá)量,用SPSS17.0軟件進(jìn)行One-Way ANOVA顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 脊尾白蝦EcMIH基因cDNA全長的克隆和序列特征分析

采用RACE方法獲得全長為1218bp,包括360bp的開放閱讀框,394bp的 3′端非編碼區(qū)(UTR)以及420bp的5'端非編碼區(qū)(UTR)的脊尾白蝦EcMIH基因,序列比較分析確定此基因?yàn)榧刮舶孜rMIH-like基因,3′端非編碼區(qū)沒有典型的多聚腺苷酸加尾信號AATAAA,有明顯的 PolyA尾(GenBank登錄號為KM103727)(圖 1)。

氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)EcMIH基因編碼區(qū)序列編碼120個(gè)氨基酸,預(yù)測的蛋白分子量為13.71kDa,理論等電點(diǎn)pI為8.02。脊尾白蝦MIH由信號肽和成熟肽組成,其N端含有41個(gè)氨基酸組成的信號肽。成熟肽由79個(gè)氨基酸組成,其中成熟肽序列含 6個(gè)非常保守的半胱氨酸殘基分別為Cys7、Cys24、Cys27、Cys40、Cys44和Cys53,第12位及第72位氨基酸殘基分別為Gly和Ile,其中Gly12是CHH家族基因中Ⅱ組的特征位點(diǎn)(Leeet al,1995),Ile72對EcMIH基因的活性有非常重要的作用(Katayamaet al,2003)。

圖1 脊尾白蝦MIH-like基因全長cDNA序列及開放閱讀框推測的氨基酸序列Fig. 1 The full-length MIH-like cDNA sequence and deduced amino acid sequence of E. carinicauda對應(yīng)的核苷酸序列的氨基酸用單個(gè)大寫字母表示。細(xì)線方框內(nèi)的atg為起始密碼子,粗下劃線表示信號肽,信號肽和成熟肽之間用豎線(/)劃分,引物序列用箭頭表示。用*表示終止密碼子。第12位及第72位氨基酸殘基Gly和Ile為CHH家族基因中Ⅱ組的特征位點(diǎn)用陰影表示

2.2 脊尾白蝦EcMIH基因同源性分析

圖2 脊尾白蝦MIH-like成熟肽氨基酸序列與其它甲殼動(dòng)物CHH家族神經(jīng)肽氨基酸序列的比對Fig. 2 Multiple alignments of E. carinicauda MIH-like mature peptide with neuropeptide amino acid sequence alignment of other Crustaceans CHH families各物種MIH序列登錄號為: 羅氏沼蝦(AAL37948.1)、日本沼蝦(AEJ54622.1)、寄居蟹屬(P55846.1)、克氏原螯蝦(P55848.1)、三疣梭子蟹(ABZ04547.1)、擬穴青蟹(AFM35653.1)、中華絨螯蟹(AAQ81640.1)、斑節(jié)對蝦(AAR89517.1)、挪威海螯蝦(AAK58133.2)、美洲海螯蝦(P55320.1)、青蝦(AEJ54623.1)、斑節(jié)對蝦(ABG33898.1)、羅氏沼蝦(AAL40916.1)、云斑厚紋蟹(AAO27806.1)、普通濱蟹(AAG29435.1)、凡納濱對蝦(BAM93361.1)、黃道蟹(P81034.1)、黃道蟹(P81035.1)

利用NCBI中的BLAST對脊尾白蝦EcMIH基因進(jìn)行同源性比較分析(圖2),發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦EcMIH基因與日本沼蝦(Macrobrachium nipponensis)和羅氏沼蝦的同源性最高,分別為 87%和 86%。脊尾白蝦MIH-like與其它蝦蟹類如寄居蟹屬(Cancer pagurus)、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)等的MIH成熟肽同源性分別為58%、51%、49%、46%、47%。與挪威海螯蝦、美洲海螯蝦、斑節(jié)對蝦和青蝦等的性腺抑制激素(gonad-inhibiting hormone,GIH)成熟肽同源性分別為61%、70%、43%、54%,與黃道蟹大顎器抑制激素(mandibular organ inhibiting hormone,MOIH)MOIH1和MOIH2成熟肽同源性為50%,與羅氏沼蝦、云斑厚紋蟹(Pachygrapsus marmoratus)、普通濱蟹(Carcinus maenas)、凡納濱對蝦的 CHH成熟肽同源性較低分別為 46%、44%、31%、36%。MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果表明(圖 3),脊尾白蝦MIH-like與羅氏沼蝦 MIH和日本沼蝦 MIH聚為一支。MIH、MOIH和GIH聚為一類,CHH單獨(dú)聚為一類,這符合高血糖激素家族基因的分類,分為 CHH Ⅰ族和CHHⅡ族(De Kleijnet al,1995)。由圖可見,所有游泳亞目(Natnatai)的 CHH家族基因聚為一類,所有爬行亞目(Peptnatia)CHH家族基因聚為一類,這符合十足目的分類(魏崇德等,1991)。

2.3 脊尾白蝦MIH基因組織表達(dá)分析

采用Real-time PCR分析了脊尾白蝦EcMIH基因在不同組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn) EcMIH基因在眼柄(830.79±0.56) 、 腹 神 經(jīng) 節(jié) (297.34±0.47) 、 腸(6.02±0.44)、心臟(65.19±0.34)、胃(2.11±0.43)和卵巢(1.00±0.36)中均有表達(dá)。而在肝臟、肌肉、鰓和血中不表達(dá)。在眼柄中的表達(dá)量最高,在卵巢中的表達(dá)量最少(圖 4)。

Real-time PCR檢測pH脅迫后不同時(shí)間脊尾白蝦眼柄和腹神經(jīng)節(jié)中EcMIH基因的表達(dá)情況如圖5所示。結(jié)果表明: 無論是低pH脅迫組(pH6.5)還是高pH脅迫組(pH9.5),EcMIH基因的表達(dá)量在脅迫 3—72h期間都顯著高于對照組(P＜0.05)。pH脅迫后,眼柄和腹神經(jīng)節(jié)中高濃度組(pH9.5) EcMIH基因表達(dá)均呈現(xiàn)先上升后下降至初始水平的趨勢,但兩者變化不完全一致,眼柄中EcMIH基因的表達(dá)量在3h達(dá)到最高(43.86±0.35),12h 達(dá)到最低(0.81±0.15),而腹神經(jīng)節(jié)在 24h達(dá)到最高(14.58±0.18),低濃度組,眼柄中EcMIH 基因的表達(dá)量在 48h達(dá)到最高(15.38±0.21),72—96h趨于正常水平,而腹神經(jīng)節(jié)中EcMIH基因的表達(dá)量在72h達(dá)到最高(3.13±0.25),96h趨于正常水平。

圖3 基于MIH-like成熟肽氨基酸序列的NJ進(jìn)化樹Fig.3 NJ tree based on MIH-like mature peptide amino acid of different species

圖4 EcMIH基因在脊尾白蝦不同組織中的表達(dá)分布Fig.4 Distribution of EcMIH gene in different tissues of E. carinicauda

Real-time PCR檢測鹽度脅迫后不同時(shí)間脊尾白蝦眼柄和腹神經(jīng)節(jié)中 EcMIH基因的表達(dá)情況如圖 7所示。鹽度脅迫后,低濃度組(鹽度4、11、18)眼柄中EcMIH基因的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后下降,而腹神經(jīng)節(jié)為先升高后下降再升高,96h后腹神經(jīng)節(jié)中無論高鹽(鹽度 39、46)還是低鹽(鹽度 4、11、18、25) EcMIH基因的表達(dá)量都顯著高于對照組(P＜0.05)。鹽度4脅迫下,眼柄中 EcMIH基因的表達(dá)量與對照組相比在3h顯著升高,但6—96h均低于對照組; 鹽度11組在3—96h均低于對照組; 而鹽度18組除3h、24h外均低于對照組。在腹神經(jīng)節(jié)中,低濃度組(鹽度4、11、18、25)在3—96h (72h除外) EcMIH基因的表達(dá)量均高于對照組(P＜0.05),但鹽度4在3h達(dá)到最高(46.94±0.41),鹽度11、18 在12h達(dá)到最高,分別為(5.93±0.32)、(4.12±0.22),鹽度 25 在 24h 達(dá)到最高(8.37±0.31)。

圖5 不同pH脅迫后EcMIH基因在眼柄(左)和腹神經(jīng)節(jié)(右)中的表達(dá)Fig.5 The expression of EcMIH gene in eyestalk (left) and ventral ganglion (right) after different pH treatments at different time同一時(shí)間點(diǎn)不同字母者表示差異顯著(P＜0.05),數(shù)據(jù)是3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,各組表達(dá)量均以與0h空白對照組相比較的倍數(shù)表達(dá)。下同

圖6 不同pH脅迫后β-actin基因在眼柄(左)和腹神經(jīng)節(jié)(右)中的表達(dá)(P＞0.05)Fig.6 The expression of β-actin gene in eyestalk (left) and ventral ganglion (right) after different pH treatments at different time (P＞0.05)

高鹽(鹽度 39、46)脅迫下,眼柄中 EcMIH 基因的表達(dá)量在3—96h均高于對照組; 但鹽度39的變化趨勢為先升高后下降的趨勢,而鹽度 46的變化趨勢為先升高后下降再升高的趨勢; 鹽度39脅迫EcMIH基因的表達(dá)量在72h達(dá)到最高(15.75±0.36),96h趨于正常水平; 鹽度46在6h達(dá)到最高(8.09±0.34),12h下降,24h升高,48h下降,72—96h再次顯著升高,分別為(1.77± 0.24)、(2.47±0.21)。

Real-time PCR檢測氨氮脅迫后脊尾白蝦眼柄和腹神經(jīng)節(jié)中EcMIH基因的表達(dá)情況如圖9所示。氨氮脅迫后,眼柄中 EcMIH基因的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后下降再升高的趨勢,而腹神經(jīng)節(jié)呈現(xiàn)先下降再升高的趨勢。腹神經(jīng)節(jié)中低濃度組、中高濃度組和高濃度組 EcMIH基因的表達(dá)量在 96h均達(dá)到最高,分別為(11.07±0.32),(1.28±0.12),(5.10±0.31); 中濃度組在72h達(dá)到最高值(8.03±0.35),而眼柄中各氨氮組的變化不完全一致,低濃度組和中高濃度組在3h達(dá)到最高(1.88±0.22),(1.32±0.11); 中濃度組在 24h達(dá)到最高(4.29±0.31),48—72h表達(dá)量下降,96h再次顯著升高(2.26±0.15); 高濃度組在 96 h達(dá)到最高(3.80±0.21)。

圖7 鹽度脅迫后EcMIH基因在眼柄(左)和腹神經(jīng)節(jié)(右)中的表達(dá)Fig.7 The expression of EcMIH gene in eyestalk (left) and ventral ganglion (right) after salinity stress

圖8 鹽度脅迫后β-actin基因在眼柄(左)和腹神經(jīng)節(jié)(右)中的表達(dá)(P＞0.05)Fig.8 The expression of β-actin gene in eyestalk (left) and ventral ganglion (right) after salinity stress (P＞0.05)

圖9 不同氨氮脅迫后EcMIH基因在眼柄(左)和腹神經(jīng)節(jié)(右)中的表達(dá)Fig.9 The expression of EcMIH gene in eyestalk (left) and ventral ganglion (right) after different NH4Cl treatments at different time

圖10 不同氨氮脅迫后β-actin基因在眼柄(左)和腹神經(jīng)節(jié)(右)中的表達(dá)(P＞0.05)Fig.10 The expression of β-actin gene in eyestalk (left) and ventral ganglion (right) after different NH4Cl treatments at different time (P＞0.05)

3 討論

甲殼動(dòng)物內(nèi)分泌學(xué)中眼柄XO-SG系統(tǒng)的研究一直備受關(guān)注。MIH是甲殼動(dòng)物所特有的家族神經(jīng)肽類激素,抑制Y器蛻皮類固醇的合成、抑制蛻皮激素的分泌,對卵巢發(fā)育也有影響,只有當(dāng) MIH分泌量減少或停止時(shí)才會(huì)導(dǎo)致蛻皮現(xiàn)象的發(fā)生。本研究根據(jù)已報(bào)道蝦蟹MIH全長cDNA序列比較其同源性,設(shè)計(jì)簡并引物,克隆得到脊尾白蝦MIH-like基因全長cDNA序列,成熟肽的同源性比較發(fā)現(xiàn),該基因與日本沼蝦MIH-like、羅氏沼蝦MIH-A和遠(yuǎn)海梭子蟹 MIH同源性最高,由此可確定脊尾白蝦MIH-like基因?yàn)榧刮舶孜r的MIH基因。脊尾白蝦MIH成熟肽序列含6個(gè)非常保守的半胱氨酸殘基,其N端含有41個(gè)氨基酸組成的信號肽,成熟肽與日本囊對蝦(Ohiraet al,2005)一致,由79個(gè)氨基酸組成; 通過比較蝦蟹類MIH氨基酸序列信號肽和成熟肽的切割位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)蟹類前2位氨基酸殘基為AA(Leeet al,2007; Stewartet al,2013)或TA(Luet al,2001)而蝦類為SA(Chenet al,2007;Toullecet al,2013); 比較成熟肽氨基酸組成,發(fā)現(xiàn)其由于近 C-端缺失了幾個(gè)氨基酸殘基,C-末端氨基酸序列的保守性較差,具有種間多態(tài)性。短尾類(蟹類)為78個(gè)氨基酸。克氏原螯蝦(Nagasawaet al,1996)和中國對蝦(王在照等,2003)為75個(gè)氨基酸。刀額新對蝦(Tiuet al,2007)為77個(gè)氨基酸,南美白對蝦(Sun,1994)為72個(gè)氨基酸,鷹爪蝦(王在照等,2002)為71個(gè)氨基酸,由此推測MIH在不同蝦體內(nèi)可能有多種不同構(gòu)型。脊尾白蝦MIH與GIH的同源性很高,與CHH的同源性很低,與其它蝦蟹類 CHH的同源性也很低,這符合CHH家族基因的分類,也說明I型肽和II型肽之間在種內(nèi)和種間存在很大差異。

甲殼動(dòng)物 MIH的組織表達(dá)目前僅見少量報(bào)道。刀額新對蝦胚胎期沒有檢測到 MIH基因的表達(dá)(Guet al,1998),銹斑蟳(Charybdis feriatus)孵化前的胚胎中檢測到MIH基因的表達(dá)(Chanetal,1998),這可能由于物種差異所致; 而在成體側(cè)向地蟹(Gecarcinus lateralis)(Leeet al,2007)、中華絨螯蟹(孫妍等,2011)、凡納濱對蝦(Sun,1994)、日本囊對蝦(Ohiraet al,1997)、可口美青蟹(Callinectes sapidus)(Leeet al,1995)、鋸緣青蟹(Scylla serrata)(Qiuet al,2003)、刀額新對蝦、銹斑蟳和日本蟳(Charybdis japonica)(沈建明等,2010)的眼柄中均檢測到 MIH的表達(dá),表明眼柄 X器官—竇腺復(fù)合體是甲殼動(dòng)物的重要神經(jīng)內(nèi)分泌器官,通過合成和分泌多種神經(jīng)多肽激素,調(diào)控甲殼動(dòng)物的性腺發(fā)育、色素反應(yīng)、蛻皮、代謝、滲透壓調(diào)節(jié)等重要生理活動(dòng)。而日本囊對蝦、可口美青蟹、鋸緣青蟹、刀額新對蝦和銹斑蟳的 MIH在腦、胸神經(jīng)節(jié)、腹神經(jīng)節(jié)中也有表達(dá),日本蟳 MIH在腦、胸神經(jīng)節(jié)、精巢和卵巢中也有表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn),脊尾白蝦 EcMIH基因在眼柄的表達(dá)量最高是卵巢的 830倍; 脊尾白蝦 MIH-like除在眼柄表達(dá)外,在腹神經(jīng)節(jié)、心臟、腸、胃和卵巢中也有表達(dá),這表明MIH表達(dá)具有較強(qiáng)的組織特異性。而MIH在這些組織的表達(dá)與眼柄的表達(dá)在功能上是否相同有待進(jìn)一步研究。

pH、鹽度、氨氮是影響海水養(yǎng)殖蝦蟹類生理生態(tài)的重要環(huán)境因子,可直接影響水生生物的存活、生長、蛻皮、繁殖和免疫活性(蔡生力等,1995)。本文分別研究了不同 pH、鹽度、氨氮脅迫對脊尾白蝦EcMIH基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在眼柄中高pH、高氨氮脅迫組(8mg/L)在脅迫 3h后EcMIH基因的表達(dá)量均上升,高鹽脅迫組(鹽度 39、46)在脅迫 3—6h后表達(dá)量上升,根據(jù)這一應(yīng)激反應(yīng),推測 MIH具有高血糖活性。而在腹神經(jīng)節(jié)中高氨氮(8mg/L)脅迫0—72h脊尾白蝦MIH的高血糖活性受到抑制,96h后MIH的表達(dá)量升高,高血糖活性抑制解除。由此推測在高氨氮(8mg/L)的環(huán)境下眼柄為MIH高血糖活性的主要調(diào)節(jié)器官; 在眼柄中,低鹽脅迫下 MIH的高血糖活性受到抑制,鹽度4脅迫,眼柄中EcMIH基因的表達(dá)量與對照組相比在3h升高,但6—96h均低于對照組; 鹽度11在3—96h均低于對照組; 而鹽度18除3h、24h外均低于對照組,而腹神經(jīng)節(jié)中,EcMIH基因的表達(dá)量在脅迫 3h后開始上升,由此推測低鹽環(huán)境下,腹神經(jīng)節(jié)為MIH高血糖活性的主要調(diào)節(jié)器官。在眼柄中各氨氮脅迫組在脅迫3h后EcMIH基因的表達(dá)量均表現(xiàn)升高,而在腹神經(jīng)節(jié)中脅迫3h后EcMIH基因的表達(dá)量均表現(xiàn)下降,由此推測氨氮脅迫環(huán)境下眼柄為 MIH高血糖活性的主要調(diào)節(jié)器官。鹽度脅迫72—96h脊尾白蝦MIH基因表達(dá)量從低鹽到高鹽的變化趨勢為先升高后降低在升高,此變化趨勢與Lago-Lestón等(2007)用不同溫度鹽度脅迫凡納濱對蝦的結(jié)果一致: 他們研究了溫度和鹽度對凡納濱對蝦幼蝦CHH和EcMIH基因的表達(dá)變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)在鹽度(18、25、39、46)脅迫24h后,EcMIH基因表達(dá)量均顯著增加(P＜0.05); 溫度對基因表達(dá)的影響高于鹽度; 鹽度(10,16,22,28,34和 40)和溫度(20°C,24°C,28°C 和 32°C)脅迫 24h,在不同鹽度脅迫下MIH-2基因的表達(dá)量明顯低于 MIH-1,且在鹽度 28表達(dá)量幾乎為零; 溫度為 20°C和 32°C時(shí)MIH基因在不同鹽度脅迫下其表達(dá)量高于溫度為24°C和28°C;溫度為28°C時(shí),MIH基因的表達(dá)量在不同鹽度脅迫24h后呈下降趨勢,且在鹽度40時(shí)MIH基因的表達(dá)量最低; 溫度為20°C脅迫24h后,MIH基因的表達(dá)量在鹽度16為最高,在鹽度22,28,34表達(dá)量下降,在鹽度40表達(dá)量上升; Liv-MIH神經(jīng)肽除了受蛻皮抑制活動(dòng)影響外還可能有其它多效性的影響(比如高血糖活性)。Chang等(1998)利用 ELISA方法研究美洲螯龍蝦,發(fā)現(xiàn)鹽度的降低、升高均能導(dǎo)致 CHH含量的增加。擬穴青蟹鹽度驟變實(shí)驗(yàn)CHH2基因的表達(dá)量顯著增加,與本研究的 EcMIH基因表達(dá)趨勢基本一致(舒妙安等,2012)。由此可推測出脊尾白蝦EcMIH基因參與了環(huán)境脅迫后的機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了脊尾白蝦 MIH-like基因全長cDNA序列,初步揭示了pH、鹽度、氨氮脅迫后該基因在眼柄和腹神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)變化規(guī)律,確定 MIH基因的表達(dá)水平與環(huán)境脅迫密切相關(guān),表明該基因參與了環(huán)境脅迫后的機(jī)體應(yīng)激反應(yīng),為甲殼動(dòng)物高血糖激素家族響應(yīng)環(huán)境脅迫的機(jī)理研究提供了參考。

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