蔣經(jīng)偉 程雨卉, 周遵春① 董 穎 陳 仲 姜 北 高 杉

(1. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院 大連 116023; 2. 大連海洋大學 大連 116023)

酚氧化酶(PO)是無脊椎動物非特異性免疫應答過程中的關(guān)鍵免疫因子,緊密參與抗菌、抑菌、病原清除等多種免疫應答過程(Mu?ozet al,2006;Cereniuset al,2008; 吳曙等,2009)。PO自身不具有任何的抗菌、抑菌活性,其免疫功能是通過氧化底物反應來實現(xiàn)的(S?derh?llet al,1998; Aladailehet al,2007)。在 O2存在的條件下,PO將酚類底物(如多巴胺、左旋多巴等)氧化成醌,醌通過非酶促反應最終轉(zhuǎn)化成黑色素,非酶促反應中生成的活性中間代謝產(chǎn)物和黑色素不僅具有顯著的抗菌、抑菌活性,還參與血細胞遷移、結(jié)節(jié)和包囊形成、損傷修復等其他免疫應答活動(Baiet al,1997; Ballarinet al,1998; Cereniuset al,2004)。

關(guān)于酚氧化酶氧化產(chǎn)物的抗菌特性研究在一些無脊椎動物物種已有報道。在煙草天蛾Manduca sexta中,純化的PO與多巴胺的反應產(chǎn)物對受試的革蘭氏陰性(G–)細菌(大腸桿菌Escherichia coli,肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumonia,綠膿假單胞菌Pseudomonas aeruginosa,鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium)和革蘭氏陽性(G+)細菌(蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus,枯草桿菌Bacillus subtilis,藤黃微球菌Micrococcus luteus,金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)的生長均有強烈抑制作用,而PO與左旋多巴的反應產(chǎn)物對上述細菌的生長幾乎無明顯影響(Zhaoet al,2007)。除具有抗菌活性外,煙草天蛾P(guān)O與多巴胺的反應產(chǎn)物還對紋夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)、噬菌體和寄生黃蜂Microplitis demolitor的卵有顯著抑制作用(Zhaoet al,2011)。淡水龍蝦Pacifastacus leniusculus血細胞破碎液上清(HLS)與多巴胺的混合物對受試的 G–細菌(嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila、大腸桿菌、綠膿假單胞菌)和 G+細菌(蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌Streptococcus pneumoniae)也有強烈抑制作用,此外,與煙草天蛾中的結(jié)果相似,淡水龍蝦 HLS與左旋多巴的混合物對上述細菌的抑制作用較弱,甚至無抑制作用(Cereniuset al,2010)。PO與多巴胺反應產(chǎn)物的抗菌活性高于PO與左旋多巴反應產(chǎn)物這一現(xiàn)象在海洋無脊椎動物櫛孔扇貝Chlamys farreri和仿刺參Apostichopus japonicus中也有發(fā)現(xiàn),然而,在上述兩個物種中,PO氧化產(chǎn)物僅對受試細菌中的部分細菌表現(xiàn)出抗菌活性(Xinget al,2012; Jianget al,2014)。純化的櫛孔扇貝PO與多巴胺的反應產(chǎn)物僅對溶藻膠弧菌Vibrio alginolyticus、副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus和殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida有顯著抑制作用,而對停乳鏈球菌Streptococcus dysgalactiae、海豚鏈球菌Streptococcus iniae、溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus和愛德華氏菌Edwardsiella tarda的生長無明顯影響(Xinget al,2012)。在仿刺參中,純化出3種PO (AjPO1,AjPO2,AjPO3),其中AjPO1、AjPO3與多巴胺反應產(chǎn)物均可抑制燦爛弧菌Vibrio splendidus和哈維氏弧菌Vibrio harveyi的生長,3種PO與多巴胺的反應產(chǎn)物對希瓦氏菌Shewanella baltica、假交替單胞菌Pseudoalteromonas nigrifaciens、溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌、擬諾卡式菌Nocardiopsissp.的生長無明顯影響(Jianget al,2014)。此外,在太平洋牡蠣Crassostrea gigas中,血細胞破碎液上清與左旋多巴的混合物對燦爛弧菌和河口弧菌Vibrio aestuarianus有顯著抑制作用(Luna-Acostaet al,2011)。上述研究表明,PO氧化產(chǎn)物的抗菌活性除了取決于底物種類外,還與PO所屬物種或PO種類有關(guān)。

光棘球海膽Strongylocentrotus nudus屬于棘皮動物門,又稱大連紫海膽,是中國北方近海重要的增養(yǎng)殖經(jīng)濟物種(湛垚垚等,2013)。近年來,隨著海膽?zhàn)B殖規(guī)模的擴大,養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)一系列病害問題,影響了海膽?zhàn)B殖的發(fā)展(王斌等,2006; 周瑋等,2008)。了解光棘球海膽的免疫特性對預防和控制海膽病害具有重要意義,而目前關(guān)于海膽PO的研究主要是體腔液中的PO活力分析(王軼南等,2011),尚缺乏PO純化和PO氧化產(chǎn)物抗菌特性研究的報道。因此本文分離純化了光棘球海膽體腔液中的 PO,并分析了光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物對不同細菌的抗菌活性,以期為海膽免疫機制的研究積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

光棘球海膽(Strongylocentrotus nudus)(23.6 ± 4.4)5只,取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院引育種中心,于實驗室暫養(yǎng)(水溫17—18°C,pH 8.6—8.8,鹽度29),備用。

1.2 實驗菌株

以燦爛弧菌、哈維氏弧菌、假交替單胞菌、希瓦氏菌、金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、溶壁微球菌和擬諾卡式菌為受試細菌(菌株信息見表 1),測定光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物的抗菌譜和抗菌活力。上述細菌在 28°C、150 r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期,取細菌培養(yǎng)懸液于 4°C、6000 ×g離心 20 min,棄上清,用生理鹽水重懸細菌沉淀至終濃度為A600=1.0。

表1 受試細菌信息Tab.1 The information of the bacteria tested

1.3 體腔液上清的制備

用滅菌注射器穿透光棘球海膽(5只)的圍口膜抽取體腔液。將 5只海膽的體腔液混勻后,離心(4°C,3500 r/min,10 min),取上清作為體腔液上清(CFS),凍存于–20°C備用。

1.4 光棘球海膽PO的分離純化

采用 Jiang等(2014)報道的線性連續(xù)梯度非變性電泳結(jié)合鄰苯二酚發(fā)色法分離光棘球海膽體腔液上清中的 PO。具體步驟如下: 以 CFS為樣品,在濃度范圍為 6%—27%的線性連續(xù)梯度聚丙烯酰胺凝膠中電泳 8 h (4°C,恒流 20 mA),使用分子量范圍為21—720 kDa的非變性電泳Marker(SERVA)作為標準蛋白; 電泳結(jié)束后,將凝膠中的一條泳道切下,浸于1%鄰苯二酚溶液中發(fā)色5 min,定位PO條帶; 根據(jù)鄰苯二酚發(fā)色結(jié)果,將未發(fā)色凝膠中的PO條帶切下,浸于生理鹽水中高速勻漿1 min,然后于4°C、14000 r/min離心30 min,取上清作為部分純化的光棘球海膽PO溶液,凍存于–20°C備用。

1.5 光棘球海膽PO活力測定

采用多巴絡合物生成法(S?derh?ll,1981)測定PO活力。使用左旋多巴或多巴胺(Sigma)作為底物,100 μL PO溶液與2.0 mL 20 mmol/L底物溶液混勻后,在490 nm波長下連續(xù)測定吸光值,A490值每分鐘增加0.001定義為1個活力單位(U)。分別以左旋多巴、多巴胺為底物,將分離得到的各PO溶液調(diào)成400 U/mL,用于抗菌活性分析。

1.6 光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物的抗菌活性分析

分別使用左旋多巴或多巴胺作為底物。100 μL細菌懸液、50 μL PO溶液與150 μL 20 mmol/L底物溶液(溶于生理鹽水)混勻后于30°C孵育1 h。孵育后的混合物離心(4°C,6000 r/min) 7 min,棄上清,將細菌沉淀用 500 μL生理鹽水重懸后,再離心(4°C,6000 r/min)7 min,棄上清,最后將細菌沉淀接種到3 mL 2216E培養(yǎng)基中進行震蕩培養(yǎng)(28°C,150 r/min)。培養(yǎng)過程中,每隔1 h取100 μL細菌培養(yǎng)懸液測定A600。對照組包括以下3種孵育方式: (1) 100 μL細菌懸液、50 μL 生理鹽水與 150 μL 20 mmol/L 底物溶液(溶于生理鹽水)混勻后于30°C孵育1 h; (2) 100 μL細菌懸液、50 μL PO溶液與150 μL生理鹽水混勻后于30°C孵育1 h; (3) 100 μL細菌懸液與200 μL生理鹽水混勻后于30°C孵育1 h。其中,對照(1)用于檢測PO底物對受試細菌生長的影響,對照(2)用于檢測光棘球海膽 PO自身對細菌生長的影響,對照(3)用作空白對照。本實驗重復3次。當PO與底物處理后的細菌生長曲線同時低于對照(1)、(2)、(3)中的細菌生長曲線,且對照(1)和(2)中的細菌生長曲線與對照(3)中的相比無明顯差別時,定義PO與底物的反應產(chǎn)物對該細菌有抗菌作用。

1.7 數(shù)據(jù)分析

抗菌活性中檢測的實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 11.5分析計算標準差,結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 光棘球海膽PO的分離純化

非變性電泳后,經(jīng)鄰苯二酚發(fā)色,共發(fā)現(xiàn) 3條PO條帶,分別呈現(xiàn)褐色、黃色和紫色(圖1)。3種PO按分子量由高到低分別命名SnPO1、SnPO2、SnPO3,3種PO的分子量均小于 Marker中的最小標準蛋白,其中 SnPO2的分子量與溴酚藍指示劑相近,而SnPO3在非變性電泳中的遷移速率要大于溴酚藍指示劑。

圖1 光棘球海膽體腔液上清非變性電泳圖Fig.1 Native-PAGE of the supernatant of coelomic fluid from S. nudus1: 非變性電泳標準蛋白; 2: 光棘球海膽體腔液上清考馬斯亮藍染色結(jié)果; 3: 光棘球海膽體腔液上清PO定位結(jié)果

2.2 光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物的抗菌活性分析

與空白對照組相比,光棘球海膽中的3種PO對受試的 8株細菌的生長均無明顯影響(數(shù)據(jù)在結(jié)果中省略)。

在受試的4株G–細菌中,光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物對燦爛弧菌和哈維氏弧菌有顯著抗菌作用(圖 2)。當以多巴胺為底物時,SnPO1的氧化產(chǎn)物對燦爛弧菌和哈維氏弧菌的生長均有抑制作用,而 SnPO2和SnPO3的氧化產(chǎn)物僅抑制哈維氏弧菌的生長; 以左旋多巴為底物時,光棘球海膽中3種PO的氧化產(chǎn)物對4種G–細菌的生長均無明顯影響。

在受試的4株G+細菌中,光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌和擬諾卡式菌有顯著抗菌作用(圖 3)。多巴胺對停乳鏈球菌有抑制作用,因此光棘球海膽PO與多巴胺的反應產(chǎn)物對停乳鏈球菌的抗菌作用無法判斷。當以多巴胺為底物時,SnPO1氧化產(chǎn)物僅抑制金黃色葡萄球菌的生長,SnPO3氧化產(chǎn)物僅抑制擬諾卡式菌的生長,而 SnPO2氧化產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌和擬諾卡式菌的生長均有抑制作用; 以左旋多巴為底物時,SnPO2氧化產(chǎn)物對擬諾卡式菌的生長有抑制作用,SnPO1和SnPO3的氧化產(chǎn)物對4種G+細菌的生長無明顯影響。

3 討論

PO作為無脊椎動物體內(nèi)的重要免疫因子,通過與底物反應生成的產(chǎn)物直接參與殺菌和抑菌過程(Baiet al,1997; Ballarinet al,1998; Cereniuset al,2004)。已有的研究表明,不同物種PO的氧化產(chǎn)物呈現(xiàn)不同的抗菌特性(Zhaoet al,2007; Xinget al,2012;Jianget al,2014),而海膽在養(yǎng)殖過程中經(jīng)常受到細菌病害的影響(王斌等,2006; 周瑋等,2008),因此了解光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物的抗菌特性對通過免疫手段預防和控制海膽細菌病害具有重要意義。

圖2 光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物對G–細菌生長的影響Fig.2 The effects of PO oxidation products on growth of Gram-negative bacteriaa: 燦爛弧菌; b: 哈維氏弧菌; c: 假交替單胞菌; d: 希瓦氏菌

不同于菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum、櫛孔扇貝和大鰲蝦Panulirus argus中檢測到的單條PO帶(Perdomo-Moraleset al,2007; 蔣經(jīng)偉等,2012;Xinget al,2012),在本研究中,作者從光棘球海膽體腔液上清中分離得到3種PO。光棘球海膽中3種PO的分子量非常小,而且在非變性聚丙烯酰胺凝膠中與鄰苯二酚反應分別呈現(xiàn)褐色、黃色和紫色的條帶,與仿刺參中的結(jié)果(Jianget al,2014)非常相似,表明光棘球海膽和仿刺參中的PO系統(tǒng)在進化上具有很高的同源性。以左旋多巴或多巴胺為底物時,光棘球海膽PO的氧化產(chǎn)物僅對哈維氏弧菌、燦爛弧菌、金黃色葡萄球菌和擬諾卡式菌有抑制作用,而對假交替單胞菌、希瓦氏菌和溶壁微球菌的生長無明顯影響,表明光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物具有窄譜抗菌活性,與櫛孔扇貝和仿刺參中的結(jié)果相似(Xinget al,2012;Jianget al,2014),不同于煙草天蛾和淡水龍蝦PO氧化產(chǎn)物的廣譜抗菌活性(Zhaoet al,2007; Cereniuset al,2010)。在受試的G–細菌中,光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物對弧菌有顯著的抗菌作用,與太平洋牡蠣、櫛孔扇貝和仿刺參等海洋無脊椎動物中的結(jié)果非常相似(Luna-Acostaet al,2011; Xinget al,2012; Jianget al,2014)。由于弧菌是海洋無脊椎動物中最常見的致病菌之一,上述結(jié)果表明,PO氧化產(chǎn)物對弧菌的顯著抗菌作用可能是海洋無脊椎動物PO免疫系統(tǒng)適應性進化的結(jié)果。光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物還對部分G+細菌有抗菌作用,與櫛孔扇貝中的結(jié)果明顯不同。在櫛孔扇貝中,PO氧化產(chǎn)物僅對部分 G–細菌有抗菌作用,而對G+細菌的生長無明顯影響(Xinget al,2012)。光棘球海膽PO和仿刺參PO在亞型組成和鄰苯二酚顯色反應上具有很高的相似性,然而在氧化產(chǎn)物抗菌譜上還是有顯著的差異。光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物顯著抑制擬諾卡式菌的生長,而仿刺參PO氧化產(chǎn)物對擬諾卡式菌無明顯的抗菌作用(Jianget al,2014)。這一結(jié)果進一步證明,不同物種間PO氧化產(chǎn)物的抗菌譜是有明顯差異的。此外,SnPO1氧化產(chǎn)物對燦爛弧菌、哈維氏弧菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用,SnPO2氧化產(chǎn)物對哈維氏弧菌、金黃色葡萄球菌和擬諾卡式菌有抑制作用,而 SnPO3氧化產(chǎn)物僅對哈維氏弧菌和擬諾卡式菌有抑制作用,表明同一物種的不同 PO亞型之間,氧化產(chǎn)物的抗菌譜也存在差異,與仿刺參中報道的結(jié)果相似(Jianget al,2014)。本研究還發(fā)現(xiàn),多巴胺氧化產(chǎn)物對燦爛弧菌、哈維氏弧菌、金黃色葡萄球菌和擬諾卡式菌有抗菌作用,而左旋多巴氧化產(chǎn)物僅對擬諾卡式菌有抗菌作用,表明在光棘球海膽中PO與多巴胺反應產(chǎn)物的抗菌活力高于PO與左旋多巴的反應產(chǎn)物。在其他一些無脊椎動物如煙草天蛾、淡水龍蝦、櫛孔扇貝和仿刺參中也發(fā)現(xiàn)多巴胺氧化產(chǎn)物的抗菌活力高于左旋多巴氧化產(chǎn)物(Zhaoet al,2007; Cereniuset al,2010; Xinget al,2012; Jianget al,2014)。有報道認為多巴胺氧化產(chǎn)物與左旋多巴氧化產(chǎn)物抗菌活力的差異是由PO催化底物后生成產(chǎn)物的成分不同造成的,PO與多巴胺反應后生成二羥吲哚,二羥吲哚及其自氧化產(chǎn)物被證明具有很強的殺菌、抑菌作用,而PO與左旋多巴反應后生成多巴醌,多巴醌及其自氧化產(chǎn)物僅具有微弱抗菌作用(Nappiet al,1992; Zhaoet al,2007)。上述推論可以從一定程度上解釋多巴胺氧化產(chǎn)物與左旋多巴氧化產(chǎn)物的抗菌活性差異,然而該推論尚無法解釋不同PO間多巴胺氧化產(chǎn)物在抗菌譜和抗菌特性上的差異,PO氧化產(chǎn)物的抗菌機制有待進一步研究。

圖3 光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物對G+細菌生長的影響Fig.3 The effects of PO oxidation products on growth of Gram-positive bacteriaa: 金黃色葡萄球菌; b: 停乳鏈球菌; c: 溶壁微球菌; d: 擬諾卡式菌

致謝擬諾卡式菌(Nocardiopsissp.)由中國科學院大連化學物理研究所海洋生物產(chǎn)品工程組惠贈,謹致謝忱。

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