李 麗，苗文靜，王 青（1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，山東日照 7686；.日照市婦幼保健院檢驗(yàn)科，山東日照 7686；.日照市人民醫(yī)院，山東日照 7686）

急性炎癥為較常見的病理過程，其常伴隨多種疾病，并對(duì)多種疾病的發(fā)生和演變產(chǎn)生重要影響。隨著人們對(duì)安全、高效藥物需求的增長(zhǎng)，天然藥物在抗炎方面的研究已備受關(guān)注。側(cè)柏葉為柏科植物的嫩枝葉，呈鱗片狀，質(zhì)地松脆，氣微香，味苦澀。古籍記載側(cè)柏葉有涼血止血、生發(fā)烏發(fā)、止咳喘的功效[1]，但目前鮮有側(cè)柏葉抗炎作用的研究。

急性炎癥由致炎因子引起，其起病急驟、維持時(shí)間較短，以滲出性病變?yōu)樘卣?。?xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）及白細(xì)胞介素-1（IL-1）等在急性炎癥發(fā)病過程中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用[2]。酸敏感離子通道（ASICs）為非電壓門控的高度通透的Na+離子通道，酸敏感離子通道1a（ASIC1a）是ASICs的一種亞型，均由細(xì)胞外酸化激活[3-4]。急性炎癥時(shí)常伴有組織酸化，ASIC1a易被激活。已有研究表明，在氟氏完全佐劑誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型中，關(guān)節(jié)軟骨ASIC1a表達(dá)明顯增加[5]。因此在本研究中，首先通過小鼠耳部涂抹二甲苯及腹腔注射0.6%醋酸制備小鼠耳廓炎癥及腹腔炎癥模型，觀察側(cè)柏葉水煎液能否減輕耳部腫脹及增加腹腔血管通透性，以期探討其抗急性炎癥作用；然后檢測(cè)側(cè)柏葉水煎液對(duì)急性耳部炎癥時(shí)血清TNF-α、IL-1水平及急性腹腔炎癥時(shí)肝組織TNF-α、IL-1及ASIC1a含量的影響，以期探討其抗急性炎癥的相關(guān)機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

DNM-9602自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；UV-6000 紫外分光光度計(jì)（上海精密儀器儀表有限公司）；GT10-1高速離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海錦岐儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

新鮮側(cè)柏葉取自濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院校內(nèi)中藥種植園，摘除大的枝干，只留針尖葉，經(jīng)筆者鑒別為真品；阿司匹林片（神威藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1309072，規(guī)格：每片25 mg）；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號(hào)：20140211）、IL-1 ELISA 試劑盒（批號(hào)：20140322）及ASIC1aELISA 試劑盒（批號(hào)：20140331）均為美國(guó)R&D Systems公司進(jìn)口分裝。

1.3 動(dòng)物

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 側(cè)柏葉水煎液 取新鮮側(cè)柏葉200 g，用剪刀剪為5 cm左右的細(xì)小枝葉，按質(zhì)量比1 ∶7的比例加水煎煮3次，每次1.5 h。合并煎液，用抽濾裝置濾過，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于60 ℃下濃縮成清膏，按1 g（生藥）/L放冷，置于4 ℃冰箱貯存。

2.1.2 阿司匹林混懸液 取阿司匹林片于研缽研碎，加蒸餾水溶解稀釋成0.25 g/L的溶液。

2.2 分組與給藥

取小鼠120 只，分成2 批，每批各取60 只分別用于觀察側(cè)柏葉水煎液對(duì)小鼠耳廓炎癥模型和腹腔炎癥模型的影響。2批小鼠均隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照（阿司匹林0.25 g/L）組和側(cè)柏葉高、中、低劑量[1、0.5、0.25 g（生藥）/L]組，依次記為A、B、C、D、E、F組，每組10只。前期研究表明，1 g（生藥）/L 側(cè)柏葉水煎液與0.25 g/L 阿司匹林的抗炎效果相似，因此為考察低于1 g（生藥）/L的側(cè)柏葉水煎液是否也具有較強(qiáng)的抗炎效果，故將1 g（生藥）/L 側(cè)柏葉水煎液經(jīng)稀釋制成1、0.5、0.25 g（生藥）/L。適應(yīng)性喂養(yǎng)小鼠3 d后，連續(xù)ig相應(yīng)藥物5 d，給藥體積為0.02 ml/g。

2.3 抗耳廓炎癥作用的考察

取“2.2”項(xiàng)下第一批6 組小鼠，除A 組小鼠涂抹等量生理鹽水外，其余各組小鼠末次給藥30 min 后左耳外耳廓雙面涂抹二甲苯50 μl復(fù)制炎癥模型，右耳不涂作為正常耳對(duì)照。左耳耳廓涂抹1 h后眼球取血1 ml，以離心半徑98.5 mm（下同）、3 000 r/min 離心10 min，取上清按試劑盒操作檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1含量。取血后脫頸椎處死小鼠，用直徑7 mm的打孔器在左右耳相同位置打下耳片，于分析天平上稱質(zhì)量并計(jì)算腫脹度和腫脹率。腫脹度＝致炎后左耳片質(zhì)量－未致炎右耳片質(zhì)量；腫脹率＝（致炎后左耳片質(zhì)量－未致炎右耳片質(zhì)量）/未致炎右耳片質(zhì)量×100%。

2.4 抗腹腔炎癥作用的考察

取“2.2”項(xiàng)下第二批6 組小鼠，除A 組小鼠ip 等量生理鹽水外，其余各組小鼠末次給藥30 min 后上腹部和下腹部分兩次ip 0.6%醋酸溶液，每次給藥體積為0.02 ml/g。60 min 后脫頸椎處死小鼠，剪開腹腔，暴露并用剪刀剪取肝臟，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4，下同）沖洗表面雜質(zhì)，剪碎。取100 mg，放入微量手動(dòng)玻璃勻漿器中，按體積比1 ∶9加入PBS于冰水中勻漿。吸取勻漿液至離心管，低溫5 000 r/min離心5 min，取上清按試劑盒操作檢測(cè)肝組織中TNF-α、IL-1、ASIC1a含量。與此同時(shí)，對(duì)各組小鼠用5 ml生理鹽水分?jǐn)?shù)次灌洗腹腔，收集灌洗液，2 500 r/min 離心5 min，取上清。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的肽鍵在遠(yuǎn)紫外區(qū)（200～250 nm）有光吸收的峰值，光吸收強(qiáng)弱在一定范圍內(nèi)與濃度成正比，且波長(zhǎng)越短光吸收越強(qiáng)。用215 nm 和225 nm 光吸收差值與單一波長(zhǎng)測(cè)定相比，可減少非蛋白質(zhì)成分引起的誤差，且差值大小與蛋白質(zhì)濃度呈正相關(guān)[6]。因此，用紫外分光光度計(jì)，以生理鹽水作為標(biāo)準(zhǔn)液，于215 nm 和225 nm 處比色，測(cè)定并計(jì)算光密度差值（ΔA＝A215nm－A225nm），以此比較各組的蛋白質(zhì)濃度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對(duì)耳廓炎癥的影響

3.1.1 血清中TNF-α、IL-1 含量 與A 組比較，B 組小鼠血清中TNF-α、IL-1含量增加；與B組比較，C、D、E、F組小鼠血清中TNF-α、IL-1含量減少；與C組比較，E、F組小鼠血清中TNF-α、IL-1 含量增加，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組耳廓炎癥模型小鼠血清中TNF-α、IL-1含量的測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 各組耳廓炎癥模型小鼠血清中TNF-α、IL-1含量的測(cè)定結(jié)果（，n＝10）Tab 1 Contents results of TNF-α and IL-1 in serum in all groups of mice with auricle inflammation（，n＝10）

表1 各組耳廓炎癥模型小鼠血清中TNF-α、IL-1含量的測(cè)定結(jié)果（，n＝10）Tab 1 Contents results of TNF-α and IL-1 in serum in all groups of mice with auricle inflammation（，n＝10）

注：與A 組比較，＊P＜0.05；與B 組比較，#P＜0.05；與C 組比較，ΔP＜0.05Note：vs.group A，＊P＜0.05；vs.group B，#P＜0.05；vs.group C，ΔP＜0.05

3.1.2 腫脹度及腫脹率 與B 組比較，C、D、E、F 組小鼠的耳廓腫脹度和腫脹率降低；與C 組比較，E、F 組小鼠的耳廓腫脹度增加，D、E、F組小鼠的耳廓腫脹率增加，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組小鼠耳廓腫脹度和腫脹率的測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠耳廓腫脹度和腫脹率的測(cè)定結(jié)果（，n＝10）Tab 2 Results of swelling degree and swelling rates in all groups of mice（，n＝10）

表2 各組小鼠耳廓腫脹度和腫脹率的測(cè)定結(jié)果（，n＝10）Tab 2 Results of swelling degree and swelling rates in all groups of mice（，n＝10）

注：與B組比較，＊P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05Note：vs.group B，＊P＜0.05；vs.group C，#P＜0.05

3.2 對(duì)腹腔炎癥的影響

與A 組比較，B 組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1、ASIC1a含量和ΔA均增加；與B 組比較，C、D、E、F 組小鼠TNF-α、IL-1、ASIC1a含量和ΔA降低；與C組比較，F(xiàn)組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1、ASIC1a含量和ΔA均增加，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組腹腔炎癥模型小鼠肝組織中TNF-α、IL-1、ASIC1a含量和ΔA的測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 各組腹腔炎癥模型小鼠肝組織中TNF-α、IL-1、ASIC1a含量和ΔA的測(cè)定結(jié)果（，n＝10）Tab 3 Contents of TNF-α，IL-1 and ASIC1ain liver tissues as well as ΔA in all groups of mice with abdominal inflammation（，n＝10）

表3 各組腹腔炎癥模型小鼠肝組織中TNF-α、IL-1、ASIC1a含量和ΔA的測(cè)定結(jié)果（，n＝10）Tab 3 Contents of TNF-α，IL-1 and ASIC1ain liver tissues as well as ΔA in all groups of mice with abdominal inflammation（，n＝10）

注：與A 組比較，＊P＜0.05；與B 組比較，#P＜0.05；與C 組比較，ΔP＜0.05Note：vs.group A，＊P＜0.05；vs.group B，#P＜0.05；vs.group C，ΔP＜0.05

4 討論

4.1 側(cè)柏葉水煎液抗急性耳廓及腹腔炎癥的作用

急性炎癥是由致炎因子導(dǎo)致的，以滲出性病變?yōu)樘卣?，起病急驟、維持時(shí)間較短的病理變化[7]。二甲苯和醋酸都是化學(xué)類的致炎因子，因此在本研究中，小鼠左耳涂抹二甲苯導(dǎo)致左耳毛細(xì)血管滲出增加，從而引起左耳明顯腫脹；小鼠腹腔注射0.6%醋酸后毛細(xì)血管通透性增加，血漿蛋白滲出到毛細(xì)血管外。因此與A組相比，B、C、D、E、F組小鼠腹腔灌洗液ΔA值明顯增大，提示本研究建模成功。與B組相比，C、D、E、F組小鼠左耳腫脹度和腫脹率明顯降低，腹腔灌洗液ΔA值明顯降低，提示側(cè)柏葉水煎液和阿司匹林有明顯降低急性炎癥導(dǎo)致的毛細(xì)血管通透性增加的作用，且側(cè)柏葉水煎液濃度越高，其抗炎作用越明顯。

4.2 側(cè)柏葉水煎液抗急性炎癥作用的相關(guān)機(jī)制

急性炎癥時(shí)，致炎因子可以刺激機(jī)體合成和分泌細(xì)胞因子，從而引起毛細(xì)血管滲出、組織腫脹、低血壓、發(fā)熱等不良作用[8]。而TNF-α是眾多細(xì)胞因子中最早出現(xiàn)的一種，其可以刺激IL 等其他細(xì)胞因子的合成與釋放，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷[9]。Dorofeeva NA等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在分離的海馬神經(jīng)元中ASIC1a表達(dá)在致炎后明顯增加，非甾體類消炎藥能明顯降低ASIC1a的表達(dá)，提示ASIC1a與炎癥的發(fā)生也密切相關(guān)。本研究顯示，在二甲苯和醋酸誘導(dǎo)的小鼠急性炎癥模型中，其血清TNF-α和IL-1含量明顯增加，肝組織TNF-α、IL-1和ASIC1a含量明顯增加，提示二甲苯導(dǎo)致的耳廓腫脹、醋酸引起的腹腔血管通透性增加和肝臟的腫脹可能與TNF-α、IL-1和ASIC1a等因素有關(guān)。而側(cè)柏葉水煎液能明顯降低由二甲苯所致的血清TNF-α和IL-1 含量的增加以及醋酸所致的肝組織TNF-α、IL-1和ASIC1a含量的增加，提示側(cè)柏葉水煎液的抗炎作用與降低TNF-α、IL-1 和ASIC1a等有關(guān)。

[1]曹雨誕，曾祥麗，單鳴秋，等.側(cè)柏葉的研究進(jìn)展[J].江蘇中醫(yī)藥，2008，40（2）：86.

[2]張莉，哈木拉提·吾甫爾.細(xì)胞因子在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)節(jié)機(jī)制[J].免疫學(xué)雜志，2006，22（3）：128.

[3]李麗.酸敏感離子通道在中樞化學(xué)感受器呼吸調(diào)節(jié)中的作用[J].中國(guó)病理生理雜志，2014，30（8）：1 400.

[4]蔣莉婭.酸敏感離子通道表達(dá)的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，20（16）：2 069.

[5]林梅英，陳飛虎，葛金芳，等.鬼針草總黃酮對(duì)急性炎癥的保護(hù)作用及可能機(jī)制的研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2013，18（6）：614.

[6]陳鈞輝.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].4版.北京：科學(xué)出版社，2008.

[7]李玉林.病理學(xué)[M].8版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013.

[8]崔巖，栗紅蕊，孫高潔，等.利拉魯肽對(duì)肥胖大鼠體質(zhì)量、血脂水平和下丘腦炎癥通路的影響研究[J].中國(guó)藥房，2014，25（17）：1 571.

[9]方劍喬，劉芳，邵曉梅.電針對(duì)角叉菜膠致炎大鼠的抗炎效應(yīng)及對(duì)白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α的影響[J].針刺研究，2007，32（4）：224.

[10]Dorofeeva NA，Barygin OI，Staruschenko A，et al.Mechanisms of non-steroid anti-inflammatory drugs action on ASICs expressed in hippocampal interneurons[J].J Neurochem，2008，106（1）：429.