HPLC法測(cè)定復(fù)方玄駒膠囊中淫羊藿苷的含量

楊炳川，楊浩然，方應(yīng)權(quán)，周 勇，龍 明，冉 宏（重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院，重慶 404000）

復(fù)方玄駒膠囊由黑螞蟻、淫羊藿、枸杞子、蛇床子等4種中藥組成，具有溫腎、壯陽(yáng)、益精之功效，臨床常用于治療腎陽(yáng)虛型患者，癥見神疲乏力、精神不振、腰膝酸軟、少腹陰器發(fā)涼、精冷滑泄、肢冷尿頻、性欲低下、功能性勃起功能障礙等[1-2]。其中，淫羊藿為方中君藥，而淫羊藿苷為淫羊藿的主要活性成分。為進(jìn)一步控制復(fù)方玄駒膠囊的質(zhì)量，本研究建立了高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定該藥中淫羊藿苷含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包含二極管陣列檢測(cè)器（日本島津公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（金壇市華歐實(shí)驗(yàn)儀器廠）；減壓干燥箱（江蘇南京海汪制藥機(jī)械裝備有限公司）；分析天平（上海市天平儀器廠）；超聲波清洗器（上海市聲波儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方玄駒膠囊（施強(qiáng)藥業(yè)集團(tuán)，批號(hào)：141001、141002、141003）；淫羊藿苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110737-200415）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Cosmosil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（55∶45，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：20 μl。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.淫羊藿苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.icariin

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密取淫羊藿苷對(duì)照品8 mg，置于50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密吸取2 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為32 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取復(fù)方玄駒膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，精密稱取0.3 g，置于具塞錐形瓶中，加乙醇適量，稱定質(zhì)量，置水浴上加熱回流提取30 min，放冷，再次精密稱定，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液10 ml，蒸干溶劑，殘?jiān)铀谷芙猓⑥D(zhuǎn)移至分液漏斗中，用乙醚振搖提取3次，每次20 ml，棄去乙醚液，水層用醋酸乙酯-水飽和的正丁醇（2∶1，V/V）的混合溶液振搖提取5次；合并提取液，蒸干溶劑，殘?jiān)蛹状际谷芙?，并轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每1 ml含淫羊藿苷49.95、99.90、199.80、299.70、399.60、499.50 μg的對(duì)照品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝54 928x+40 162（r＝0.999 7）。結(jié)果表明，淫羊藿苷的質(zhì)量濃度在49.95～499.50 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.06%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液適量，分別于配制0、2、4、6、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝1.6%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品約1 g，共6份，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品含量。結(jié)果，RSD＝1.8%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批樣品各適量，共6份，分別精密加入淫羊藿苷對(duì)照品溶液各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.8 樣品含量測(cè)定

取3批次（批號(hào)：141001、141002、141003）的樣品各1.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，3批樣品的含量分別為4.058、5.161、4.350 mg/g，平均含量為4.523 mg/g。

3 討論

目前，文獻(xiàn)報(bào)道中關(guān)于淫羊藿苷的含量檢測(cè)方法有紫外分光光度法、導(dǎo)數(shù)光譜法、室溫?zé)夥?、薄層掃描法、高效液相色譜法、毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法等[3]，但最為常見的為HPLC法。淫羊藿苷具有可溶解于乙醇、乙酸乙酯的性質(zhì)。在實(shí)驗(yàn)中，筆者曾嘗試使用30%、50%、70%的乙醇分別回流提取2次、3次、4次，并進(jìn)行含量比較。結(jié)果顯示，70%的乙醇提取效率最高，且醇提3次和4次的淫羊藿苷含量明顯較醇提2次高，但醇提3次和4次之間淫羊藿苷含量無明顯差異，因此選擇70%乙醇回流醇提3次的工藝。

經(jīng)全波長(zhǎng)掃描，淫羊藿苷在270 nm波長(zhǎng)處吸收較大，結(jié)果與2010版《中國(guó)藥典》記載一致。因此，確定淫羊藿苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。在流動(dòng)相的選擇上，有文獻(xiàn)報(bào)道乙腈-水有拖尾影響[4-5]，筆者嘗試使用甲醇-水、甲醇-0.1%冰醋酸、乙腈-3.8%冰醋酸（28∶72，V/V）、甲醇-磷酸水溶液（55∶45，V/V）為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇-磷酸水溶液（55∶45，V/V）出峰良好，且分離度高，陰性樣品對(duì)測(cè)定無干擾，淫羊藿苷的保留時(shí)間約為9 min，保留時(shí)間、分離度及淫羊藿苷理論板數(shù)均符合要求。

綜上所述，本研究建立的含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單易行、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于復(fù)方玄駒膠囊的質(zhì)量控制。

[1]張訊，梁季鴻，梁世坤，等.復(fù)方玄駒膠囊聯(lián)合他莫昔芬治療特發(fā)性少精子癥的臨床研究[J].中華男科學(xué)雜志，2012，18（7）：661.

[2]王欣，蘇晶石，楊可為，等.復(fù)方玄駒膠囊治療前列腺炎的療效觀察[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（10）：2 045.

[3]尹志峰，劉敬閃，張?zhí)m桐.淫羊藿苷的含量測(cè)定方法[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23（8）：47.

[4]崔曉紅，袁志芳，張?zhí)m桐.益腎強(qiáng)身片中淫羊藿苷的含量測(cè)定[J].中國(guó)新藥雜志，2005，14（11）：78.

[5]凌云.HPLC法測(cè)定不同批號(hào)復(fù)方玄駒膠囊中淫羊藿苷的含量[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10（19）：23.