沈卓之楊 珉

生物等效性研究中的統(tǒng)計學問題

沈卓之1楊 珉2

生物等效性（bioequivalence，BE）評價是藥代動力學的重要課題之一，也是近年來統(tǒng)計學應用的熱點領域［1－5］。盡管一般藥物BE評價的統(tǒng)計方法已基本趨于成熟，但現(xiàn)有的統(tǒng)計方法尚有值得商榷之處，且仍有文獻報道中存在試驗設計和統(tǒng)計處理的缺陷。本文擬對生物等效性研究中存在的幾個統(tǒng)計學問題進行文獻復習討論。

試驗設計

生物等效性研究中的試驗設計主要有交叉設計、平行設計、平衡的不完全區(qū)組設計等幾種方法。只要實際操作上可行，各國指導原則均建議生物等效性試驗盡量采用交叉設計的方法［5］。

1．交叉設計（cross-over design）

在大多數(shù)生物等效性檢驗中，一般均采用交叉設計的方法，即每個病人或研究對象輪流接受每一種處理方法，他們在兩個或多個時刻接受不同的處理［6］。這是由于生物利用度測量值的個體存在差異，而個體間的變異系數(shù)往往遠大于個體內(nèi)變異系數(shù)。交叉設計可以將個體間的變異分離出來，提高檢驗的敏感性和準確性，有效規(guī)避個體間變異給試驗帶來的偏倚［7］。

交叉設計有不同的設計類型，主要表現(xiàn)在不同順序（sequence）不同階段（period）的不同處理（treatment）的安排上。在生物等效性試驗最基本且最常用的是兩處理、兩階段、兩序列的交叉設計，也稱2×2交叉設計［8］。隨著等效性試驗的發(fā)展，多階段交叉試驗設計應運而生，該設計在一次試驗中能同時比較多種處理因素，如試驗包括3種藥物（2個試驗藥和1個參比藥）時，則宜采用3處理3階段的3×3拉丁方試驗設計［9］。多階段交叉試驗設計是將不同的研究對象按照事先設計好的不同的試驗次序，在不同的時期逐次實施多種處理，以檢驗試驗藥和參比藥是否具有生物等效性的一種設計方法。

平均生物等效性（average bioequivalence，ABE）或群體生物等效性（population bioequivalence，PBE）研究時不一定必須采用重復交叉設計，但個體生物等效性（individual bioequivalence，IBE）研究由于個體內(nèi)方差以及個體與藥物的交互作用，必須采用重復交叉設計［10］。而對于某些高變異性藥物（highly variable drug），根據(jù)具體情況，除采用增加例數(shù)的辦法外，也可采用重復交叉設計，對同一受試者兩次接受同一制劑時可能存在的個體內(nèi)差異進行測定。Patterson等建議［11］，在不增加試驗人次的情況下，采用重復交叉設計或組別-隊列設計（group-sequencial design）［12］，增大等效性試驗的檢驗效能。換言之，重復交叉設計可以在相同的檢驗效能下，減少受試者數(shù)目，這將極大減少因擴大受試者數(shù)目而帶來的倫理學問題。當然，它也有一定缺點：每個受試者需接受多種處理，因此需要較多的時間，受試者的失訪或退出會影響整個試驗。

對兩種藥物進行比較，常見的重復交叉設計有以下幾種［13］：

（1）2×4重復交叉設計：在四個用藥階段中，兩種藥物按兩個或多個順序進行試驗。常用設計有：

若以上順序均采用，則為4×4重復交叉設計。

（2）2×3重復交叉設計：在三個用藥階段中，兩種藥物按兩個或多個順序進行試驗。常用設計有：

（3）Balaam重復交叉設計：如果采用兩階段的交叉設計，則需要多個順序才能得到個體內(nèi)變異和個體與藥物的交互作用。

2001年FDA指南指出，對于IBE的評價，若采用2×4設計，推薦（TRTR，RTRT）順序；而對于2×3設計，則推薦（TRT，RTR）順序。

對于FDA指南中的推薦，學術(shù)界提出的問題主要有以下幾點：

（1）在總例數(shù)一定的前提下，哪種設計的有效性更高［14－15］。

（2）若與不同用藥順序的其他交叉設計相比較，如（TRRT，RTTR）、（TTRR，RRTT）、（TRR，RTT）、（TTR，RRT）等，何者為優(yōu)［16－18］。

（3）若重復交叉設計中存在缺失數(shù)據(jù)，如何評價其PBE和IBE［19，20］。

對于以上問題，目前從統(tǒng)計學角度進行的研究尚不多。呂靜靜、于浩、陳峰等學者［21－23］采用Monte Carlo模擬研究對生物等效性試驗的檢驗效能和樣本含量估計作了較系統(tǒng)的研究。結(jié)果表明，4×4交叉設計的效率最高，其次為2×4交叉設計、2×3交叉設計、2×2交叉設計，平行組的設計效率不足交叉設計的一半，而Balaam設計的效率最低。因此，實際工作中，如果增加兩個階段時間的試驗成本不是很高，且受試者有較好的依從性，推薦使用2×4設計或4×4設計來進行生物等效性試驗。

2．平行設計

平行設計即完全隨機設計［24－25］，每組受試者例數(shù)相同，每個個體隨機接受一種藥物或藥物的一種劑型。平行設計常用于Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗，在生物等效性研究中并不常用。因為通常而言，觀察次數(shù)相等時，檢測產(chǎn)品的差異時用交叉設計比平行設計更加有效。但在以下情況下，平行設計優(yōu)于交叉設計：（1）個體間變異性比個體內(nèi)變異性??；（2）因藥物半衰期較長，洗脫期相應較長，研究時間延長，增加了個體失訪的機會，造成數(shù)據(jù)脫落；（3）受試者需多次進行血液采樣，不易實施。

順序效應（Sequence Effect）

順序效應常與殘留效應（carry-over effect）以及處理與階段（時期）的交互效應相混淆［26－28］。殘留效應是指：如果A、B兩種藥物均對下一階段無影響或者影響相同，則AB與BA兩種順序的效應相等或相近，此時該效應混在階段效應中，即可以忽略它的影響；如果A影響B(tài)，而B不影響A；或者A對B的影響不等于B對A的影響，則AB和BA兩種順序的效應不相同，此時就不能忽略其影響，且表現(xiàn)在第二階段的處理效果中［29］。

順序效應因其在一定程度上反映了殘留效應的大小，常常被認為就是指藥物殘留效應，實際上這只是最常見的一種。除此以外，還有心理效應（psychological carry-over effect）、第一階段用藥導致耐藥性而產(chǎn)生的撤退效應（withdrawals effect），以及病人身體狀況因用藥而改變所導致的遺留效應（nonuniform carry-over effect）等等［30］。它們均可通過合理的設計來去除（雙盲法可去除心理效應，適當?shù)男コ龝r間可去除大部分其他種類的順序效應，安慰劑一般不會和有效藥物產(chǎn)生相互作用）。

在目前交叉設計常用的統(tǒng)計方法中，一般未考慮試驗順序?qū)υ囼灲Y(jié)果可能產(chǎn)生的影響，但這在很多情形下是不能忽略的。李曉松、張文彤等學者［31－32］運用多水平統(tǒng)計模型，在模型水平2隨機部分擬合順序效應的隨機系數(shù)。順序不同，試驗結(jié)果在患者間的變異不同，即在患者間變異（即水平2方差）中進一步分解出順序的效應。但若將此方法運用于生物等效性評價中，由于在水平2隨機部分引入了順序效應，勢必會影響個體間變異的估計值，導致等效標度（criterion）的估計出現(xiàn)偏差，該問題的解決方法尚需進一步研究。

綜上，無論是多階段交叉設計、平行設計或是提出新的統(tǒng)計模型，在改善順序效應的同時也都有不足之處，目前似乎尚未找到兩全之策。正如Senn［33－34］所建議，是否存在順序效應的影響應當基于生物學機制、藥理和臨床專業(yè)知識，只要所接受的處理不是內(nèi)源性物質(zhì)，不同處理間隔的洗脫期足夠長，建議對順序效應采取簡化處理，而非單純針對其建模。關鍵是在試驗的設計階段就應考慮到順序效應的存在，減少統(tǒng)計分析時所設置的不合理的假設。

樣本含量

ABE評價的僅僅是總體均數(shù)的差異，樣本含量可直接通過公式估計這里Δ代表生物等效性的容許界值，例如log（1．25）或log（0．80）；θ是log（μT／μR）或?qū)?shù)轉(zhuǎn)換后兩藥效應的差別。當μT／μR大于1時，Δ取log（1．25），否則Δ取log（0．80）［37］。可見，與臨床試驗的樣本含量估計一樣，生物等效性試驗的樣本含量N也由以下三個基本因素決定：（1）顯著性水平：通常取0．05；（2）檢驗效能，一般為80%；（3）變異性和差別（θ）：兩藥ABE評價中檢測指標的變異性越大，所需例數(shù)越多；且在不超出容許界值的假設下，θ值越大，所需例數(shù)越多［38］。

表1 ABE研究中不同變異度的樣本含量標

PBE和IBE的評價統(tǒng)計量是均數(shù)和變異的綜合指標，所以它們的樣本含量只能通過模擬給出［39］。最理想的設計，是采用最少的受試者例數(shù)達到所需檢驗效能來判斷兩種制劑是否生物等效［40］。以下樣本量推薦均來自2001年FDA正式發(fā)布的《生物等效性統(tǒng)計分析指導原則》［13］中采用Monte Carlo模擬研究估算出的樣本含量。

1．ABE研究的樣本含量

在不同國家頒布的生物等效性（ABE）研究指南中，對受試者例數(shù)的要求有所差別，美國為12～36例，歐盟須＞12例，日本為20～30例，我國則要求18～24例健康男性，目前尚缺乏國際的一致性標準。但我國現(xiàn)行《新藥審批辦法》《藥品注冊管理辦法》［41－42］均指出，對于高變異藥物（個體內(nèi)變異＞30%），應當適當增加樣本量，以保證試驗有適當?shù)臋z驗效能，以避免出現(xiàn)不等效的假陰性結(jié)果。

2．PBE、IBE研究的樣本含量

評價PBE、IBE的統(tǒng)計量是由效應值的均數(shù)、方差、個體內(nèi)的方差以及個體與藥物的交互作用組成，因此樣本含量的估計是基于模擬數(shù)據(jù)產(chǎn)生的。該模擬數(shù)據(jù)的T與R的平均等效性在方差和個體-藥物之間交互作用相同的情況下，其變異度不超過5%，樣本的檢驗效能應達到80%～90%。

表2 PBE研究中不同變異度的樣本含量

而IBE的樣本含量因不同的個體內(nèi)變異和個體與藥物間的交互作用、設計而不同。需值得注意的是：FDA規(guī)定每一個序列的最小樣本含量為6，所以當模擬結(jié)果的樣本含量小于6時，在IBE評價試驗中，應以6為每順序的樣本含量進行試驗［43］。

對數(shù)變換

評價生物等效性的統(tǒng)計方法，其基本假設是數(shù)據(jù)服從或近似服從正態(tài)分布，這也是方差分析的前提條件［44－45］。當數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布時，常需進行對數(shù)轉(zhuǎn)換來校正其對稱性。這是因為生物等效性評價是以藥代動力學為基礎的，所依據(jù)的藥物血液中時間-濃度公式為c（t）＝Ae－λt［37］。當時間t＝0時的藥物濃度為A，λ是消減常率。只有當兩藥的時間-濃度函數(shù)相等，即cT（t）＝cR（t）時，兩藥才能相互替換。這時的等效性可表為log（AT）－λT＝log（AR）－λR。在等效假設下，總有期望值λT＝λR，因而可用對log（AT）＝log（AR）的假設檢驗獲得等效性的推斷。由此可知：（1）藥代動力學參數(shù)以原始尺度進行分析，其效應不是可加性的，而對數(shù)轉(zhuǎn)換可用加法模型進行處理；（2）AUC和Cmax通常為正偏態(tài)分布，且方差不齊，對其作對數(shù)變換可以改善其分布的偏性，縮小方差間的差異；（3）進行對數(shù)變換后，用方差分析和雙單側(cè)t檢驗，分析藥代動力學參數(shù)的可靠性和檢驗效能更好。因此FDA指導原則中明確要求，生物等效性的統(tǒng)計分析應在藥代動力學參數(shù)的對數(shù)尺度下進行。而生物等效性的評價是在還原原始尺度后的兩藥效比值及其90%可行區(qū)間下進行的。

然而有學者認為［24－45］，F(xiàn)DA指南要求對所有參數(shù)均進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，這并非總是正確的。Patel［46］同樣認為，將原始數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后再進行線性分析的策略并不是“科學”的方法。因為在BE研究中樣本容量是有限的，即使采用對數(shù)變換也不能從根本上對一組數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布作出可靠結(jié)論。

此外，根據(jù)以上等效評價原理，F(xiàn)DA要求，統(tǒng)計分析的結(jié)果要用對數(shù)尺度的，還需提供原始尺度的，即將對數(shù)結(jié)果取反對數(shù)轉(zhuǎn)換。然而，原始尺度的對數(shù)轉(zhuǎn)換有可能因為非線性函數(shù)的逆轉(zhuǎn)換而引入偏差。例如，均值之比的點估計，若以對數(shù)尺度計算的結(jié)果取反對數(shù)來作為其原始尺度的結(jié)果，將會造成偏倚，并且總是正偏倚（positive bias）的。再有，將對數(shù)尺度上的標準差取反對數(shù)，顯然并非其原始尺度上的標準差。結(jié)果應如何在原始尺度上進行表達，尤其是變異（方差）的表達，還需更進一步的研究。

值得注意的幾個問題

1．關于普通t檢驗和雙單側(cè)t檢驗（two-one-sided test，TOST）

目前，我國ABE評價試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析，主要是用藥動學參數(shù)AUC和Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后以多因素方差分析進行顯著性檢驗，然后對其幾何均值進行雙單側(cè)t檢驗，以及計算90%置信區(qū)間的方法來評價和判斷藥物間的生物等效性［47］。方差分析法提供了其他評價方法都需用到的標準差，是包括雙單側(cè)t檢驗在內(nèi)的其他評價方法的基礎。對于方差分析和雙單側(cè)t檢驗的異同，已有文獻報道［24］。在實際應用中，僅采用成組／配對t檢驗的情況仍時有發(fā)生，差異性t檢驗和雙單側(cè)t檢驗的意義和相互關系模糊不清，在此進行討論。

成組／配對t檢驗是差異性檢驗，而雙單側(cè)t檢驗是等效性檢驗，這是本質(zhì)完全不同的兩種檢驗。成組／配對t檢驗的無效假設是兩藥有無差異，只在P＜0．05時才認為兩藥差異有統(tǒng)計意義，但不一定不等效；P＞0．05時認為兩藥差異無統(tǒng)計意義，但并不能認為兩者等效。

而等效性檢驗意在確定兩藥差別無臨床意義，其無效和備擇假設是：

H0：（μA≠μB）；H1：（μA＝μB）。給定一個臨床意義下的容許差值d后，得到以下式：

等效檢驗是對H0中的兩個假設進行，故稱雙單側(cè)t檢驗（TOST）。設定的無效假設是兩藥不等效，受試藥在參比藥一定范圍之外，在P＜0．05時說明受試藥沒有超過規(guī)定的參比藥的高限和低限，可認為兩藥等效［37］。等效性檢驗離不開等效標準，差異顯著性檢驗則與等效標準無關。要證明兩藥的藥效相近，絕不能僅以P＞0．05為依據(jù)，必須作雙單側(cè)t檢驗。

2．關于Tmax的分析

生物等效性評價的三個指標中，AUC、Cmax通常服從對數(shù)正態(tài)分布，相應的統(tǒng)計檢驗分析方法發(fā)展得比較成熟、完全。但作為反映藥物吸收速率的指標Tmax，其重要性常有意或無意地被研究者忽略，統(tǒng)計檢驗分析方法也常照搬AUC、Cmax的方法。有學者認為，Tmax根據(jù)實測值得到，是一種離散的計數(shù)資料，服從參數(shù)Poisson分布［48］，并不符合方差分析的假設基礎，因而建立在方差分析上的雙單側(cè)t檢驗法和90%置信區(qū)間法不適用于Tmax的統(tǒng)計檢驗［24，49］。還有學者認為Tmax的分布性質(zhì)是未知的，有時其數(shù)據(jù)太偏離正態(tài)分布，以致即使在處理平均值時也不能接受正態(tài)假設［50］。因此一般采用非參數(shù)方法（亦稱為無分布統(tǒng)計）對Tmax進行檢驗，它可以對顯著性水平做一個快速的近似估計。

盡管新藥研究指導原則對于Tmax的統(tǒng)計分析作出了非參數(shù)檢驗的要求［51］，但目前發(fā)表的生物等效性研究文章以及新藥申報資料中仍有一部分按照雙單側(cè)t檢驗法和90%置信區(qū)間法對Tmax進行統(tǒng)計分析［52－53］。而在統(tǒng)計分析中，等效區(qū)間界值的取值范圍，也常借用AUC、Cmax的取值范圍（80%～125%或70%～143%），或自定取值范圍，或沒有說明等效界值范圍，缺乏有力的證據(jù)支持。其實質(zhì)是沒有考慮Tmax的分布特點，機械重復AUC、Cmax的統(tǒng)計檢驗方法。

雖然采用非參數(shù)檢驗法的秩和檢驗考慮到了Tmax的分布，但由于秩和檢驗法是一種差異性檢驗而非等效性檢驗。當秩和檢驗法能作出兩藥Tmax存在差異的統(tǒng)計判斷時，尚不能得到兩藥以Tmax為指標生物等效的統(tǒng)計結(jié)論［54］?？紤]到后一情況在生物等效研究中更常見，而目前對于以Tmax為藥代動力學指標來評價BE尚缺乏深入研究，因此有必要針對Tmax發(fā)展適當?shù)慕y(tǒng)計檢驗方法，并探索相應的等效界值［55］。

另外，即使用非參數(shù)方法檢驗出兩藥間Tmax存在顯著差異的結(jié)論，也可從以下兩個方面考慮：（a）非參數(shù)方法的檢驗效能較t檢驗或F檢驗可能稍低；（b）一般的等效性檢驗主要還是針對AUC和Cmax的檢驗，對于Tmax，僅僅在藥物釋放快慢與臨床療效和安全性密切相關時才需要著重關注，故應當運用醫(yī)學專業(yè)知識判斷其在等效性檢驗中的權(quán)重［24，56］。

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（責任編輯：鄧 妍）

1．重慶市疾病預防控制中心慢病所（400042）

2．四川大學華西公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生政策和管理系