楊秀娟，陳纘光，陳倩瑜（1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣州 51080；.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006；.佛山市順德區(qū)北滘醫(yī)院，廣東佛山 5811）

僵蠶來源于蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx moriLinnaeus 4～5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌Beauveria bassiana（Bals.）Vuillant而致死的干燥體，具有催眠、抗驚厥、息風(fēng)止痙、清熱解毒、祛風(fēng)化痰及散結(jié)等功效[1]。而相關(guān)研究表明，僵蠶抗驚厥作用的主要有效成分是其體表白色粉末中含有的草酸銨[2]。不同的產(chǎn)地、不同的炮制方法以及白僵菌的繁殖條件都會影響僵蠶中草酸銨的含量[3]。目前，有關(guān)文獻報道的關(guān)于僵蠶中草酸銨含量測定的方法主要有高效液相色譜法[4-5]、高效毛細管電泳法[6]、示波電位滴定法[7]、高錳酸鉀氧化還原滴定法[8]等。高效液相色譜法的應(yīng)用范圍廣、分離效率高、定量效果好，為目前最為常用的分析方法，但其流動相消耗大，且多為有毒的有機溶劑，對操作者和環(huán)境有一定的危害，另分析成本相對較高。而高效毛細管電泳法雖然需樣量少、靈敏度高，但是毛細管容易損壞。示波電位滴定法是將高錳酸鉀法與示波器結(jié)合起來指示終點的方法，該方法比高錳酸鉀氧化還原滴定法更為直觀靈敏、簡便快速，但是滴定結(jié)果專屬性差，準確性易受溫度、酸度、滴定速度的影響。使用微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測的方法目前尚未見報道。

筆者建立了采用微流控芯片非接觸電導(dǎo)法測定僵蠶中草酸銨的含量。該方法儀器集成程度高、操作簡單，使用具有強分離效能的微流控芯片進行分離，而所用的非接觸式電導(dǎo)檢測避免了電極與溶液接觸，壽命長，成本低，靈敏度較高，為僵蠶的質(zhì)量控制提供一種高效、準確的分析方法。

1 材料

PMMA（Polymethyl methacrylate，聚甲基丙烯酸甲酯）十字通道芯片（微通道上寬30 μm，下寬100 μm，深30 μm，進樣通道為十字結(jié)構(gòu)，分離通道長44 mm，有效分離長度43 mm。大連理工大學(xué)微系統(tǒng)研究中心提供）；非接觸電導(dǎo)檢測器（兩電極間的距離0.6 mm。中山大學(xué)藥學(xué)院提供）[9]；微型壓電陶瓷高壓電源（中山大學(xué)藥學(xué)院提供）[10]；SHZ-D（Ⅰ）型循環(huán)水式真空泵（鞏儀市英峪予華儀器廠）；色譜工作站（中山大學(xué)醫(yī)藥儀器與應(yīng)用研究所），數(shù)據(jù)記錄與處理在普通P4微機上完成。

僵蠶（購自北京同仁堂廣州藥業(yè)連鎖有限公司，產(chǎn)地：四川，批號：20140702、20140703、20140704），經(jīng)中山大學(xué)姚美村副教授鑒定為蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx moriLinnaeus 4～5齡的幼蟲感染白僵菌Beauveria bassiana（Bals.）Vuillant而致死的干燥體；草酸銨對照品（廣州化學(xué)試劑廠，分析純，純度≥99.5%）；2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES，上海晶純試劑有限公司，超級純）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，F(xiàn)arca Chemical Supplies，優(yōu)級純）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，水為二次蒸餾水。所有試劑使用前均經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

緩沖體系：3 mmol/L Tris+3 mmol/L檸檬酸（pH＝3.0）；分離電壓：2.0 kV；進樣時間：10.0 s；不加添加劑；非接觸電導(dǎo)檢測器激發(fā)電壓：60 V（Vp-p）；頻率：60 kHz。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 準確稱取草酸銨對照品0.010 0 g，加水溶解并定容于10 ml量瓶中，得質(zhì)量濃度為1.00 mg/ml的對照品貯備液，于4 Ⅰ下保存。臨用前用緩沖溶液稀釋成各濃度的對照品溶液。由于對照品溶液中所含的緩沖溶液配比與電泳介質(zhì)的配比相同，因此可以消除背景干擾。進樣前經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾。

2.2.2 供試品溶液 取僵蠶樣品適量，研碎，取約1.0 g，精密稱定，將其轉(zhuǎn)移至50 ml錐形瓶中，加入30 ml二次蒸餾水，后將錐形瓶放入50 Ⅰ恒溫水浴鍋中加熱2 h，并不時用玻璃棒進行攪拌。然后過濾，濾渣加入少量二次蒸餾水繼續(xù)加熱提取，充分提取僵蠶中的草酸銨，得到的待測樣品溶液再用濾紙過濾至100 ml量瓶中，定容，于4 Ⅰ下保存?zhèn)溆?，作為供試品貯備液。臨用時用緩沖溶液稀釋10倍，作為供試品待測液，使得待測液中的緩沖溶液配比與電泳介質(zhì)中的相同，消除背景干擾。進樣前經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾。

2.3 緩沖溶液種類

考察不同種類緩沖溶液對草酸銨分離檢測的影響。在NaH2PO4-Na2HPO4、NaH2PO4-硼砂、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，草酸銨不出峰；在Tris-硼酸緩沖溶液中，雖然基線較為穩(wěn)定，草酸銨出峰明顯，但峰形較差，且為3個峰（如圖1中A圖所示）；在醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，草酸銨出峰明顯、峰形較好，但基線不穩(wěn)定（如圖1中B圖所示）；在Tris-檸檬酸緩沖溶液中，基線穩(wěn)定，基線噪音較低，草酸銨峰響應(yīng)高、峰形較好、出峰時間短，是較理想的緩沖溶液（如圖1中C圖所示）。因此，優(yōu)化選擇Tris-檸檬酸作為緩沖溶液。

2.4 線性關(guān)系考察和檢測限

按“2.2.1”項下方法配制質(zhì)量濃度為1.0～200 μg/ml的系列對照品溶液，按“2.1”項下試驗條件進行測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得草酸銨的回歸方程為y＝0.755 4x+2.037（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，草酸銨質(zhì)量濃度在10～150 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。檢測限為3.0 μg/ml（以信噪比為3計算）。

2.5 精密度試驗

準確吸取1.00 mg/L的草酸銨對照品溶液5.00 ml，加入緩沖溶液稀釋100倍，得50 μg/ml的草酸銨對照品溶液，按“2.1”項下試驗條件重復(fù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，草酸銨峰面積的RSD為1.6%，表明儀器精密度良好。

圖1 草酸銨在不同緩沖溶液中的芯片毛細管電泳色譜圖A.Tris-硼酸；B.醋酸-醋酸鈉；C.Tris-檸檬酸；1.草酸銨Fig 1 Microchip capillary electropherograms of ammonium oxalate in different buffer solutionsA.Tris-H3BO3；B.HAc-NaAc；C.Tris-citric acid；1.ammonium oxalate

2.6 穩(wěn)定性試驗

取樣品（批號：20140702）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品待測液，4 Ⅰ下保存，分別于放置0、2、4、6、8 h時按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，草酸銨峰面積的RSD為1.8%，表明供試品待測液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批次的樣品（批號：20140702）適量，共6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品待測液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，草酸銨峰面積的RSD為1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密量取“2.2.2”項下供試品貯備液1 ml（批號：20140702），共9份，分別置于10 ml量瓶中，加入草酸銨對照品（1.00 mg/ml），然后加入適量的緩沖溶液，定容至10.0 ml。按“2.1”項下試驗條件進行測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.9 樣品含量測定

取“2.2”項下供試品待測液和對照品溶液（經(jīng)緩沖溶液適當稀釋）適量，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄電泳圖，見圖2。

取3批樣品（批號：20140702、20140703、20140704），按“2.2.2”項下方法制備供試品待測液，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算出草酸銨的質(zhì)量濃度，從而得出其質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表2。

圖2 芯片毛細管電泳譜圖A.對照品；B.供試品；1.草酸銨；2、3.未知物Fig 2 Microchip capillary electropherogramsA.reference；B.test samples；1.ammonium oxalate；2-3.unknown impurities

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 緩沖溶液

草酸銨在各種不同緩沖溶液的出峰情況結(jié)果見“2.3”項。草酸銨在NaH2PO4-Na2HPO4等緩沖溶液中不出峰，可能與緩沖溶液的電導(dǎo)與樣品的電導(dǎo)相差不大有關(guān)；而在Tris-硼酸緩沖溶液中分為3個峰，可能是由于草酸銨與緩沖溶液中的硼酸生成了配合物；在醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，基線不穩(wěn)定，可能是由于緩沖溶液離子強度過大。因此，最后優(yōu)化選擇Tris-檸檬酸作為緩沖體系。

除了種類，緩沖溶液中兩組分比例和濃度對分離檢測也有較大的影響。筆者分別考察了Tris（2～5 mmol/L）和檸檬酸（2～5 mmol/L）不同濃度配比的緩沖體系對分離檢測的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當兩組分中Tris配比低時，峰形出現(xiàn)拖尾，可能是因為低離子強度的緩沖液造成了樣品的吸附；當Tris配比高時，峰形得到改善，但靈敏度下降；當檸檬酸配比高時，基線噪音增加。結(jié)果顯示，兩者比例為1∶1時，峰形與基線均較好。因此，優(yōu)化Tris和檸檬酸比例為1∶1。試驗發(fā)現(xiàn)，隨著Tris和檸檬酸總體濃度的增大，電流也隨著增大，焦耳熱效應(yīng)使基線噪聲也隨之增加，影響分離檢測效果。因此，綜合考慮基線噪音及穩(wěn)定性、出峰情況等分離檢測效果，優(yōu)化選擇3 mmol/L Tris+3 mmol/L檸檬酸（pH＝3.0）作為緩沖體系。

3.2 添加劑

一般情況下，向背景電解質(zhì)中加入添加劑可影響電滲流、遷移率和控制焦耳熱等，從而改善電泳分離分析效果。試驗中考察了乙醇、甲醇、丙酮、丙二醇、β-環(huán)糊精（β-CD）、十二烷基磺酸鈉（SDS）等幾種添加劑不同添加量對分離檢測效果的影響。結(jié)果顯示，加入乙醇（1%～5%，體積分數(shù)，下同）、甲醇（1%～5%）以及丙酮（1%～5%）后，雖然草酸銨峰形變好，但基線漂移，這可能是由于醇類和酮類物質(zhì)具有揮發(fā)性，從而導(dǎo)致基線上飄；加入丙二醇（1%～5%）后，峰形變差，重復(fù)性不好，而且基線不穩(wěn)定，這可能是丙二醇的黏度大及其吸濕性造成；加入β-CD（5%～10%）和SDS（5%～10%），對分離檢測無改善，且基線不穩(wěn)定，噪音增大。綜合上述檢測效果，優(yōu)化選擇緩沖溶液中不加添加劑。

3.3 進樣時間

筆者又考察了進樣時間為5.0～20.0 s時對草酸銨分離和檢測的影響。隨著進樣時間的延長，峰高與峰面積呈增大趨勢；但當進樣時間超過10.0 s后，峰高增加的幅度減少，這可能是由于進樣時間過長，進樣量超出了芯片檢測的載樣量；而且隨著進樣時間的增加，峰出現(xiàn)展寬和拖尾。綜合考慮，優(yōu)化選擇進樣時間為10.0 s。

3.4 分離電壓

在微流控芯片系統(tǒng)中，分離電壓的大小可以直接影響電場強度的大小，從而影響物質(zhì)的遷移速度。而增加組分的遷移速度是減少譜帶展寬、提高分離效率的重要途徑。因此，本研究考察了分離電壓1.0～2.5 kV對樣品檢測效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著分離電壓的增加，峰高逐漸增加，峰形尖銳，出峰時間縮短，信噪比增加。但是，過高的分離電壓可產(chǎn)生較大的電流，使電泳體系產(chǎn)生大量的焦耳熱，基線噪音隨之增大、信噪比下降，從而影響檢測效果。綜合考慮峰形、靈敏度、噪音以及出峰時間等因素，優(yōu)化選擇分離電壓為2.0 kV。

綜上所述，該方法簡便、快速、重復(fù)性好，為僵蠶的質(zhì)量控制提供了一種新方法。

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