楊立勇， 方彥玲， 沈喜妹

CXCL10對βTC6細胞TLR4表達及細胞凋亡的影響

楊立勇， 方彥玲， 沈喜妹

摘要:目的探討CXC趨化因子配體10(CXCL10)對βTC6細胞Toll樣受體4(TLR4)表達及細胞凋亡的影響。方法體外培養(yǎng)βTC6細胞，0.1～10.0 ng/mL CXCL10分別干預(yù)βTC6細胞12,24,48 h后，應(yīng)用Western-blot檢測TLR4表達情況，流式細胞術(shù)和DNA Ladder檢測細胞凋亡情況。結(jié)果與對照組比較，CXCL10干預(yù)12 h，10.0 ng/mL干預(yù)組開始出現(xiàn)TLR4蛋白的表達水平上調(diào)(0.840±0.049，P<0.05)；干預(yù)24 h，1.0和10.0 ng/mL 干預(yù)組TLR4的表達水平上調(diào)[分別為(0.851±0.052)和(0.893±0.030)，P<0.05]；干預(yù)48 h，1.0和10.0 ng/mL干預(yù)組TLR4的表達進一步上調(diào)[分別為(0.876±0.046)和(0.923±0.027)，P<0.05]，且各干預(yù)濃度兩兩比較，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CXCL10干預(yù)βTC6細胞24 h，僅10.0 ng/mL干預(yù)組細胞出現(xiàn)DNA梯狀條帶；干預(yù)時間延長至48 h，1.0和10.0 ng/mL干預(yù)組均出現(xiàn)DNA梯狀條帶。流式細胞術(shù)顯示，CXCL10誘導細胞凋亡呈濃度依賴性。結(jié)論長時間高濃度的CXCL10作用將導致TLR4表達顯著上調(diào)，并誘導β細胞凋亡。

關(guān)鍵詞:趨化因子CXCL10； 胰島/細胞學； Toll樣受體4； 糖尿病

糖尿病的炎癥涉及多種炎癥因子，研究提示，CXC趨化因子配體10(CXC chemokine ligand-10, CXCL10)與糖尿病的病理生理機制密切相關(guān)[1-3]。CXCL10屬于CXC家族的趨化因子，又名干擾素誘導蛋白10(interferon-γ inducible protein-10, IP-10)，1985年由Luster等經(jīng)由干擾素-γ(IFN-γ)刺激U937細胞株后、用雜交的方法從cDNA基因庫中篩選出來[2]。β細胞自身合成并分泌CXCL10是吸引CXCR3+的T細胞浸潤胰島的自身免疫損傷啟動因素。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)是先天免疫激活炎癥信號轉(zhuǎn)導通路中的關(guān)鍵因子，近年在2型糖尿病慢性低度炎癥的發(fā)病機制中的作用備受關(guān)注[4]。目前已證實，體內(nèi)脂毒性直接誘導的β細胞炎性凋亡主要通過激活β細胞的TLR4，啟動炎癥信號級聯(lián)實現(xiàn)[5]。本研究探討CXCL10對βTC6細胞TLR4表達及細胞凋亡的影響，報告如下。

1材料與方法

1.1細胞及試劑小鼠胰島素瘤細胞系(mouse insulinoma line)βTC6(美國標準生物品收藏中心)，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);CXCL10(美國PeproTech公司);兔抗小鼠TLR4多克隆抗體(美國Bioworld公司)，細胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)；Annexin V/PI流式試劑盒(美國BD公司)。

1.2分組根據(jù)CXCL10的濃度將實驗分為4組：對照組和不同濃度CXCL10干預(yù)組(0.1,1.0,10.0 ng/mL)；根據(jù)干預(yù)時間將實驗分為3組：12,24及48 h干預(yù)組。

1.3方法

1.3.1分離RNA及蛋白質(zhì)上述βTC6細胞用0.25%胰蛋白酶消化細胞，經(jīng)洗滌、離心，加入1 mL Trizol充分裂解細胞，按照說明書分離純化細胞核及細胞質(zhì)蛋白質(zhì)，純化的蛋白質(zhì)按照BCA蛋白定量試劑盒說明書測定總濃度。

1.3.2TLR4蛋白表達分析細胞裂解液裂解后分別提取質(zhì)蛋白和核蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取等量的蛋白樣品50 μg，用樣品緩沖液處理，蛋白變性、SDS-PAGE膠電泳分離蛋白、電轉(zhuǎn)移法使蛋白轉(zhuǎn)移至PDVF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉2 h以減少非特異性結(jié)合，封膜后加入TLR4抗體(1∶300)或β-Actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后以辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶3 000)孵育，室溫下輕搖2 h，TBST洗膜后用ECL化學發(fā)光法曝光顯影，洗片后用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)對Western-blot的條帶進行掃描，然后用Quantity One軟件進行分析。

1.3.3觀察DNA Ladder按照細胞凋亡DNA Ladder抽提試劑盒說明書抽提DNA，用1%的瓊脂凝膠電泳分析，紫外燈下拍照。

1.3.4檢測細胞凋亡情況按上述方法培養(yǎng)細胞后以0.25%的胰蛋白酶充分消化細胞，離心、收集細胞，用PBS洗滌3遍，用100 μL緩沖液調(diào)整細胞濃度為1×106mL-1單細胞懸液。分別加入5 μL的A液及B液后，避光放置15 min。加入緩沖液，調(diào)節(jié)終體積為500 μL，于流式細胞儀上檢測，用Coulter分析系統(tǒng)分析檢測結(jié)果。

2結(jié)果

2.1CXCL10干預(yù)后βTC6細胞TLR4蛋白表達的改變(1)CXCL10干預(yù)12 h，與對照組(0.781±0.021)比較，0.1和1.0 ng/mL CXCL10干預(yù)組βTC6細胞TLR4的表達無明顯變化，分別為(0.799±0.029)和(0.819±0.034)(P>0.05)；10.0 ng/mL CXCL10干預(yù)組TLR4的表達水平上調(diào)[(0.840±0.049)，P<0.05]。(2)CXCL10干預(yù)24 h，與對照組(0.794±0.023)比較，0.1 ng/mL CXCL10干預(yù)組βTC6細胞TLR4的表達無明顯變化[(0.818±0.032)，P>0.05]；1.0和10.0 ng/mL CXCL10干預(yù)組TLR4的表達水平上調(diào)，分別為(0.851±0.052)和(0.893±0.030)(P<0.05)。各干預(yù)濃度兩兩比較，10.0 ng/mL CXCL10組TLR4的表達水平比0.1 ng/mL CXCL10組上調(diào)(P<0.05)，余各組差別無統(tǒng)計學意義。(3)CXCL10干預(yù)48 h，與對照組(0.784±0.030)比較，0.1 ng/mL CXCL10干預(yù)組TLR4的表達無明顯變化[(0.825±0.030)，P>0.05]；1.0和10.0 ng/mL CXCL10干預(yù)組TLR4的表達水平上調(diào)，分別為(0.876±0.046)和(0.923±0.027)(P<0.05)。各干預(yù)濃度兩兩比較，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。

A、B、C、D分別為對照組及0.1,1.0,10.0 ng/mL CXCL10干預(yù)組.圖1　CXCL10對βTC6細胞TLR4蛋白表達的影響Fig 1　The effects of CXCL10 on TLR4 protein expression in βTC6 cells

2.2CXCL10干預(yù)下βTC6細胞中的DNA Ladder干預(yù)12 h，不同濃度CXCL10干預(yù)組均未出現(xiàn)明顯DNA Ladder；干預(yù)24 h，10 ng/mL CXCL10干預(yù)組出現(xiàn)明顯DNA Ladder，0.1 ng/mL和1.0 ng/mL CXCL10干預(yù)組無DNA Ladder；干預(yù)48 h，1.0 ng/mL和10.0 ng/mL干預(yù)組均出現(xiàn)了不同的DNA Ladder(圖2)。

A、B、C、D分別為對照組及0.1,1.0,10.0 ng/mL CXCL10干預(yù)組.圖2　CXCL10對βTC6細胞DNA Ladder的影響Fig 2　The effects of CXCL10 on DNA Ladder in βTC6 cells

2.3CXCL10干預(yù)下βTC6細胞的凋亡情況經(jīng)流式細胞儀檢測，CXCL10干預(yù)βTC6細胞48 h，隨CXCL10濃度增高(0.1～10.0 ng/mL)，凋亡細胞相應(yīng)增加。與對照組(1.5±0.45)%比較，1.0和10.0 ng/mL CXCL10干預(yù)組的凋亡率差別有統(tǒng)計學意義，分別為(13.6±0.74)%和(20.2±0.81)%(P<0.05，圖3)。

A、B、C、D分別為對照組及0.1,1.0,10.0 ng/mL CXCL10干預(yù)組.圖3　CXCL10對βTC6細胞凋亡的影響Fig 3　The effects of CXCL10 on apoptosis of βTC6 cells

3討論

糖尿病患者常伴有血漿CXCL10水平增高，CXCL10的代謝異常不僅將影響糖尿病患者體內(nèi)胰島β細胞的功能狀態(tài)，而且將導致β細胞的生存障礙[1,3,6]。CXCL10對胰島β細胞的損害可能是糖尿病患者胰島β細胞功能失代償?shù)脑蛑?，從而為探討炎癥和糖尿病的關(guān)系提供了新的線索。研究顯示，正常健康人群中血清CXCL10的濃度為41.0~186.0 pg/mL；在體外實驗中，文獻通常采用的CXCL10干預(yù)濃度為0.1~50.0 ng/mL[1,7]。本研究在預(yù)實驗階段曾采用含0.1~50.0 ng/mL CXCL10的DMEM培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高于30.0 ng/mL濃度的CXCL10容易從培養(yǎng)液中析出結(jié)晶，最終采用0.1,1.0及10.0 ng/mL 3種干預(yù)濃度。在干預(yù)時間的選擇上，實驗采用的是βTC6細胞株，每一代的最佳生長周期約72 h。實驗總體設(shè)計是預(yù)先給予CXCL10干預(yù)，而后尋求相應(yīng)的保護措施，結(jié)合文獻，最終選擇12,24,48 h 3個干預(yù)時間點。結(jié)果顯示，低濃度的CXCL10干預(yù)β細胞并未發(fā)現(xiàn)損害作用，提示生理濃度的CXCL10并無毒性作用。當提高CXCL10干預(yù)濃度或延長干預(yù)時間時，CXCL10表現(xiàn)出對β細胞的損害作用，表現(xiàn)為β細胞TLR4蛋白的表達顯著上升，且細胞出現(xiàn)凋亡，與文獻報道一致[1]。Paroni等報道了TLR4通路可能是CXCL10誘導β細胞凋亡的途徑[8]。Schulthess等報道了CXCL10可通過TLR4信號損害胰島β細胞的功能，誘發(fā)糖尿病[9]。

本研究尚發(fā)現(xiàn)，TLR4蛋白表達上升出現(xiàn)在細胞凋亡之前，且兩者的變化呈平行關(guān)系，提示CXCL10可能通過上調(diào)TLR4蛋白的表達而誘導β細胞凋亡。涉及的相關(guān)機制可能如下：CXCL10可結(jié)合于胰島β細胞上的TLR4受體，通過MyD88依賴性路徑，持續(xù)的活化PI3K-AKT及JNK等信號轉(zhuǎn)導通路，誘導Caspase-3活化及PAK2的裂解，下調(diào)胰島素mRNA的表達，使細胞葡萄糖刺激的胰島素分泌減少，并誘導細胞凋亡。同時可能是通過MyD88非依賴型途徑來上調(diào)細胞內(nèi)CXCL10的表達[10]，大量炎癥因子(包括CXCL10)的合成及釋放反過來促進TLR4/NF-κB活化，以正反饋調(diào)節(jié)機制使NF-κB誘導活性繼續(xù)增加，誘發(fā)更大量致炎因子的生成形成“瀑布效應(yīng)”[11-13]。因此，CXCL10可能通過結(jié)合胰島β細胞上的TLR4受體，啟動細胞內(nèi)凋亡通路直接誘導胰島β細胞凋亡。同時通過TLR4通路，促進胰島β細胞大量炎癥因子(包括CXCL10)的合成及釋放，使CXCR3陽性靶細胞向炎癥病灶趨化，最終導致所有β細胞的死亡及糖尿病的發(fā)生。

糖尿病的發(fā)病機制迄今尚未完全闡明，糖尿病仍然是人類社會面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。目前炎癥與胰島β細胞功能衰退的關(guān)系仍在進一步研究探討中，繼續(xù)這方面的分子機制研究，并尋求相應(yīng)的靶向干預(yù)措施，從而為保護β細胞的結(jié)構(gòu)和功能提供思路和依據(jù)，為糖尿病的防治提供可能的新途徑。

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(編輯：何佳鳳)

The Intervening Effects of CXCL10-induced Impairment and TLR4 Expression in βTC6 Cells

YANG Liyong, FANG Yanling, SHEN Ximei

Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the changes of TLR4 expression and apoptosis in β cells induced by CXCL10.MethodsInsulinoma cell line βTC6 cells were cultured in vitro, treating with CXCL10(0.1, 1.0, 10.0 ng/mL) for 12 to 48 hours, then the expression of TLR4 of the βTC6 cells and apoptosis were determined by Western-blot, DNA Ladder and flow cytometry.ResultsCompared with the control group, the βTC6 cells intervened with CXCL10 for 12 hours at 10.0 ng/mL showed an upregulated TLR4 expression (0.840±0.049, P<0.05); when intervened for 24 hours, the upregulated TLR4 expression was shown for the intervention with CXCL10 at 1.0 and 10.0 ng/mL (0.851±0.052 and 0.893±0.030 respectively, P<0.05); when intervened for 48 hours, further upregulated expressions were shown for the intervention with CXCL10 at 1.0 and 10.0 ng/mL (0.876±0.046 and 0.923±0.027 respectively, P<0.05).Statistical analysis of each two CXCL10 intervention groups showed significant differences (P<0.05).When the βTC6 cells were intervened with CXCL10 for 12~24 hours, DNA Ladder appeared at 10.0 ng/mL, while the DNA Ladder appeared at both 1.0 and 10.0 ng/mL if the intervention time period was extended to 48 hours.ConclusionsCXCL 10 at high concentration and long intervention time could change the expression of TLR4 and induce βTC6 cells apoptosis.

KEY WORDS:chemokine CXCL10; islets of Langerhans/cytology; Toll-like receptor 4; diabetes mellitus

作者簡介:楊立勇(1957-)，男，主任醫(yī)師，教授，醫(yī)學博士. Email: yly_lm@sina.com

基金項目:國家自然科學基金(81370912)

收稿日期:2014-09-24

中圖分類號:R329.24； R392.12； R587.1

文獻標志碼:A

文章編號:1672-4194(2015)01-0007-04

作者單位: 福建醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，福州350005