• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看

      ?

      銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯對大鼠腦缺血再灌注損傷后VEGF 的表達(dá)的影響

      2015-03-11 05:55:46劉秀萍
      關(guān)鍵詞:內(nèi)酯陽性細(xì)胞腦缺血

      劉秀萍,鄧 方

      缺血性腦血管病主要是由于血管病變引起血流中斷或減少,導(dǎo)致相應(yīng)血管供應(yīng)區(qū)缺血缺氧而發(fā)生一系列病理生理反應(yīng)。而促進(jìn)損傷區(qū)域局部血管再生,建立良好的側(cè)支循環(huán)是缺血后重要的代償機制[1]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)于1989 年由Ferara 等在牛垂體濾泡星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)液中分離純化,是胚胎期血管新生和血管形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物。VEGF 及其受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)系統(tǒng),在缺血性腦血管病的微循環(huán)重建過程中起著至關(guān)重要的作用,可能是腦缺血后血管新生調(diào)控的中心環(huán)節(jié)[2]。銀杏內(nèi)酯(ginkgolides,GK)和白果內(nèi)酯(bilobalide,BB)是銀杏葉制劑中最為有效的成份,但其對于腦缺血后血管生成方面卻鮮有文獻(xiàn)報道。為深入研究其對急性腦缺血再灌注損傷的作用機制,本研究從血管新生角度,觀察了GK 和BB 對腦缺血的保護作用及對缺血側(cè)皮質(zhì)VEGF 和VEGER-1 表達(dá)的影響。

      1 材料和方法

      1.1 實驗動物 清潔級雄性Wistar 大鼠,體重260~280g,吉林大學(xué)實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(吉)2013-0001。

      1.2 藥物與試劑 GK(四川成都百裕公司提供,批號:20130801)和白果內(nèi)酯(四川成都百裕公司提供,批號:NZ130609),兔抗大鼠VEGF 抗體,VEGFR-1 抗體,β-actin,羊抗兔二抗,免疫組化試劑盒(PV-6000,GBI),BCA 蛋白定量試劑盒,濃縮型DAB 試劑盒、ECL 顯影液。

      1.3 實驗分組 將實驗動物隨機分為假手術(shù)組(Sham 組)、MCAO+鹽水對照組(Saline 組)、MCAO+GK 組(10 mg/kg,GK 組)、MCAO+BB 組(10 mg/kg,BB 組),每組6 只。每組動物于腦缺血再灌注前30 min 腹腔給藥,假手術(shù)組和鹽水對照組給予等量生理鹽水。

      1.4 大鼠腦缺血再灌注模型的制備 參照Zea Longa 改良線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)。具體方法為:以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,仰臥位固定,碘伏消毒,經(jīng)頸部正中切口暴露頸動脈三角。手術(shù)分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈,結(jié)扎頸外動脈和頸總動脈,在頸外動脈近分叉處剪一“V”字形切口,將直徑為0.26 mm、賴氨酸包被的鈍性魚線線栓斜行插入,通過頸內(nèi)動脈推進(jìn)到大腦中動脈,插入約18~20 mm 遇有阻力時為止。縫合肌肉和皮膚,術(shù)中保持大鼠肛溫在37 ℃±0.5 ℃Sham 組不插線栓,余操作相同。

      1.5 神經(jīng)功能評分、腦梗死體積測定 按Zea Longa 5 分制評分法對大鼠進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn):0分:無神經(jīng)功能損傷癥狀;1 分:對側(cè)前爪不能完全伸展;2 分:向右側(cè)轉(zhuǎn)圈;3 分:向右側(cè)傾倒;4 分:不能自發(fā)行走,意識喪失。入組標(biāo)準(zhǔn)為:評分為1~3分,且無蛛網(wǎng)膜下腔出血。大鼠腦缺血2 h 再灌注12 h 后,麻醉后迅速取腦,于-20 ℃冰箱中速凍18 min,然后將腦組織放入腦槽中,沿腦組織冠狀切面切成5 片,隨后將腦片放入2%TTC 溶液中,37 ℃避光置水浴箱30 min。再將腦片置于4%多聚甲醛溶液固定4~6 h 后,數(shù)碼相機拍照,應(yīng)用圖像分析軟件計算腦片梗死面積。

      1.6 腦組織病理組織學(xué)檢查 大鼠腦缺血2 h再灌注12 h 后,用10%水合氯醛麻醉,迅速開胸,用生理鹽水沖洗心臟,然后用4%多聚甲醛灌注固定,斷頭取腦,置于相同灌注液,4 ℃后固定1 w,依次脫水透明浸蠟及包埋,常規(guī)HE 染色封片,光鏡下觀察。

      1.7 免疫組織化學(xué)法檢測VEGF 及VEGFR-1的表達(dá) 取大鼠腦組織冰凍切片,嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說明書操作,3% H2O2室溫孵育,滴加一抗(兔抗VEGF、VEGFR-1,工作濃度分別均為1∶200)后滴加二抗,經(jīng)蒸餾水沖洗、蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。陽性細(xì)胞計數(shù):在400 倍光學(xué)顯微鏡下分別隨機選取5 個視野,計數(shù)免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)后取平均值。

      1.8 Western blot 檢測VEGF 及VEGFR-1 的表達(dá) 取缺血側(cè)大腦皮質(zhì)進(jìn)行蛋白提取,BCA 法測定蛋白濃度。蛋白變性后行SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜封閉,分別加入一抗(VEGF,1∶1000;VEGFR-1 抗體,1∶1000;β-actin,1∶2000),4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶2000)室溫孵育,ECL液顯色,凝膠成像系統(tǒng)顯影。采用Image J 圖像分析測定Western blot 條帶灰度值,結(jié)果以VEGF 及VEGFR1 與β-actin 灰度值的比值顯示。

      2 結(jié)果

      2.1 GK 和BB 對腦缺血/再灌注大鼠腦梗死范圍及神經(jīng)功能缺損的影響 TTC 染色結(jié)果提示:假手術(shù)組腦組織未見梗死灶,Saline 組腦組織梗死面積百分比為(41.09±1.33);與Saline 組相比,GK 組和BB 組腦梗死范圍減小(梗死面積百分比分別為23.8±0.58 和26.97±0.73)(P<0.01),提示GK 和BB 對缺血/再灌注腦損傷有確切的保護作用。在神經(jīng)功能損傷方面,假手術(shù)組無神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀,Saline 組均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺陷表現(xiàn),GK 組和BB組則明顯改善大鼠神經(jīng)癥狀(P<0.01,P<0.05)。提示GK 和BB 對大鼠神經(jīng)功能損傷有明顯的改善作用(見表1、圖1)。

      2.2 VEGF 及VEGFR-1 蛋白的表達(dá)變化VEGF 蛋白含量明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在GK 和BB 組,VEGF 蛋白表達(dá)較缺血再灌注組顯著增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。VEGFR-1 蛋白的表達(dá)在各組間表達(dá)量基本相同,無統(tǒng)計學(xué)差異(見圖2)。

      2.3 組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 組織切片經(jīng)HE 染色,于400×光鏡下觀察。Sham 組未見明顯病理改變,各種神經(jīng)細(xì)胞層次清晰,細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)多樣化,胞核界限清晰,胞質(zhì)均勻,可清晰見到細(xì)胞核。Saline組見大鼠腦缺血中心區(qū)大量神經(jīng)元變性壞死,細(xì)胞排列紊亂,形態(tài)不規(guī)則,可見部分神經(jīng)元胞質(zhì)濃縮,胞核固縮、碎裂或溶解。GK 和BB 組與Saline 組相比,梗死區(qū)縮小,神經(jīng)元損傷程度減輕,細(xì)胞排列尚規(guī)則,殘存的細(xì)胞形態(tài)相對正常,GK 組殘留的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)較BB 組稍多(見圖3)。

      2.4 VEGF 及VEGFR-1 陽性細(xì)胞的表達(dá)變化組織切片經(jīng)免疫組化染色,于400×光鏡下觀察。Sham 組可見少量VEGF 及VEGFR-1 表達(dá)陽性細(xì)胞,分布于在脈絡(luò)叢及軟膜等處。缺血2 h/再灌注12 h 后,基底節(jié)處缺血病灶區(qū)可見VEGF 及VEGFR-1 免疫陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯增加,主要分布在缺血病灶周邊的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。陽性細(xì)胞胞漿內(nèi)呈明顯棕黃色著色。GK 組和BB 組較Saline 組陽性表達(dá)部位相似,陽性表達(dá)率較Saline 組顯著增高(見圖4)。

      表1 各組再灌注12 h 神經(jīng)功能評分、腦梗死體積百分比比較(±s,n=6)

      表1 各組再灌注12 h 神經(jīng)功能評分、腦梗死體積百分比比較(±s,n=6)

      與假手術(shù)組比較#P<0.01;與鹽水對照組比較* P<0.05,**P<0.01

      圖1 大鼠腦缺血再灌注12 h 后神經(jīng)功能評分(A);腦梗死體積(B)

      圖2 大鼠再灌注12 h Western blot 示VEGF、VEGFR-1 蛋白水平的表達(dá)

      3 討論

      本研究采用線栓法制備大鼠腦缺血/再灌注模型,從血管新生角度觀察了GK 和BB 的神經(jīng)保護作用。結(jié)果顯示:GK 和BB 能明顯改善缺血/再灌注后大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀,減小腦梗死范圍,減輕組織形態(tài)學(xué)改變。此前的研究證明,受損的腦組織可出現(xiàn)再塑性,神經(jīng)元發(fā)生的機制均與血管再通有重要的相關(guān)性,所以血管生成可以為大腦修復(fù)提供新的思路[3,4]。VEGF 是內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原,具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、加速新生血管形成、提高血管通透性等生物學(xué)特性,有類似于血管源性的神經(jīng)保護和神經(jīng)營養(yǎng)作用。在腦缺血發(fā)生后,VEGF 能誘導(dǎo)新生血管形成,并使新生血管從正常組織向半暗帶及缺血中心區(qū)延伸,增加受累腦組織再灌注及供氧量,從而減輕腦缺血損傷。有研究發(fā)現(xiàn),VEGF 參與了局部梗死周邊區(qū)的微血管形成作用和血液供應(yīng)的改善[5]。VEGF 還可間接地促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生并抑制細(xì)胞凋亡[6,7]。目前己經(jīng)證實,缺血及移植損傷能顯著上調(diào)神經(jīng)元及星狀細(xì)胞VEGF 的表達(dá)。在多種生理和病理情況下以旁分泌的形式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體,產(chǎn)生不同的生物作用,包括:(1)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化和遷移,以及體內(nèi)血管的生成;(2)增加血管通透性;(3)促進(jìn)血管支持物的生成等[8]。VEGFR-1 主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞上,其胞外部分對VEGF 具有很高的親和力,能以可溶形式存在[9]。VEGF 主要通過VEGFR-1在內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)揮作用[9],促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、微血管管型結(jié)構(gòu)形成及成熟血管生成[10]。

      本研究免疫組化及Western blot 結(jié)果證明,大鼠缺血再灌注損傷后,缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)VEGF 的表達(dá)明顯提高,這可能是機體對抗缺血缺氧所致腦組織損害的一種自身保護方式。而GK 和BB 能刺激機體VEGF 分子表達(dá)上調(diào),從而增強其誘導(dǎo)血管生成的功能,促進(jìn)了新生血管的形成和側(cè)支循環(huán)的重建,進(jìn)而增加局部腦血流量,提高腦組織對葡萄糖和氧的攝取,加快神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)并有效縮小腦梗死的最終體積。免疫組化結(jié)果顯示,在GK 組和BB 組中,VEGFR-1 的陽性細(xì)胞數(shù)較Saline 組明顯增多,表明GK 和BB 在促進(jìn)VEGF 表達(dá)的同時還能通過促進(jìn)其受體的表達(dá)進(jìn)一步增強缺血區(qū)血管生成。然而遺憾的是,Western blot 結(jié)果顯示不同組VEGFR-1 的表達(dá)量沒有明顯的差異。對這一結(jié)果,分析可能有以下幾方面的原因:首先,本研究選取的時間點為缺血2 h/再灌注12 h,可能GK 和BB 促進(jìn)VEGFR-1的表達(dá)上調(diào)的作用通過半定量的Western blot 還沒有充分顯現(xiàn),延長觀察時間可能會發(fā)現(xiàn)其上調(diào)趨勢;其次,雖然給藥后免疫組化證實了表達(dá)VEGFR-1 的陽性細(xì)胞數(shù)增多,但是單個神經(jīng)元表達(dá)的VEGFR-1的量較小,其蛋白總量變化較小,提高檢測手段的靈敏度可能有助于檢出其變化情況;第三,VEGFR 存在兩種亞型,GK 和BB 可能對VEGFR-1 和VEGFR-2 均有作用,但可能對VEGFR-2 的影響更大,因此選用針對亞型的抗體可能更好地揭示其變化規(guī)律,尚需進(jìn)一步證實。但從以上實驗結(jié)果,仍可證實GK 和BB 確實可以通過促進(jìn)血管生成發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用。銀杏葉制劑已廣泛應(yīng)用于缺血性腦血管病的臨床治療,針對其應(yīng)用價值和作用機制已進(jìn)行了很多研究,證明了銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯具有抗炎、抗凋亡等作用[11,12]。但此前研究所用的銀杏葉制劑多為混合成份,未能分辨其不同成份間的作用差異,機制探討難于深入。本研究選用了單一成份的銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯進(jìn)行研究,并比較了兩者的作用差異。從血管新生的角度,本研究證實了兩者可有效促進(jìn)血管生成,且銀杏內(nèi)酯組具有更顯著的變化趨勢。在隨后的研究中我們將進(jìn)一步深入探討。

      本研究證實,銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯可以通過激活血管內(nèi)皮生長因子上調(diào),進(jìn)而促進(jìn)新生血管形成,在腦梗死再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用,這可能為腦梗死患者的治療和預(yù)防提供新的靶點。

      圖3 大鼠腦缺血再灌注12 h 各組大鼠HE 染色(HE×400)

      圖4 大鼠缺血再灌注12 h 后免疫細(xì)胞化學(xué)染色VEGF、VEGFR-1 的表達(dá)(×400)

      [1]Oshikawa J,Urao N,Kim HW,et al.Extracellular SOD-derived H2O2promotes VEGF signaling in caveolae/lipid rafts and post-ischemic angiogenesis in mice[J].Plos one,2010,5(4):e10189.

      [2]何佳,丁鳳菲,劉敏珍,等.VEGF/VEGFR 在腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護作用[J].神經(jīng)損傷與功能,2013,3(8):177-180.

      [3]Chopp M,Li Y,Zhang J.Plasticity and remodeling of brain[J].J Neurol Sci,2008,265(1~2):97-101.

      [4]Chopp M,Zhang ZG,Jiang Q.Neurogenesis,angiogenesis and MRI indices of functional recovery from stroke[J].Stroke,2007,38(2):827-831.

      [5]Liu F,Ni J,Huang J,et al.VEGF overexpression enhances the accumulation of phospho-S292 MeCP2 in reactive astrocytes in the adult rat striatum following cerebral ischemia[J].Brain Res,2014,14:1683-1687.

      [6]Yang J,Yao Y,Chen T,et al.VEGF ameliorates cognitive impairment in in vivo and in vitro ischemia via improving neuronal viability and function[J].Neuromolecular Med,2014,16(2):376-388.

      [7]Greenberg DA,Jin K.VEGF and ALS:The luckiest growth factor[J].Trends Mol Med,2004,10(1):1-3.

      [8]Goncalves GA,Camargo-Kosugi CM,Bonetti TC,et al.p27kip1 overexpression regulates VEGF expression,cell proliferation and apoptosis in cell culture from eutopic endometrium of women with endometriosis[J].Apoptosis,2014,23:246-248.

      [9]Freitas AM,Carmeliet P,Stanimirovic DB,et al.VEGFR-2-mediated increased prolifertion and survival in response to oxygen and glucose deprivation in PlGF knockout astrocytes[J].Neurochem,2008,107(3):756-767.

      [10]Chiba Y,Sasayama T,Miyake S,et al.Anti-VEGF receptor antagonist(VGA1155)reduces infarction in rat permanent focal brain ischemia[J].Kobe J Med Sci,2008,54(2):136-146.

      [11]Goldie M,Dolan S.Bilobalide,a unique constituent of Ginkgo biloba inhibits inflammatory pain in rats[J].Behav Pharmacol,2013,24:298-306.

      [12]WuX,Qian Z,Ke Y,et al.Ginkgolide B preconditioning protects neurons against ischaemia-induced apoptosis[J].J Cell Mol Med,2009,13:4474-4483.

      猜你喜歡
      內(nèi)酯陽性細(xì)胞腦缺血
      穿心蓮內(nèi)酯滴丸
      穿心蓮內(nèi)酯固體分散體的制備
      中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:27
      蒙藥如達(dá)七味散中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量測定
      大口黑鱸鰓黏液細(xì)胞的組織化學(xué)特征及5-HT免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的分布
      原花青素對腦缺血再灌注損傷后腸道功能的保護作用
      血必凈對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制
      細(xì)胞外組蛋白與腦缺血再灌注損傷關(guān)系的初探
      α-甲氧甲?;?γ-丁內(nèi)酯和α-乙氧甲?;?γ-丁內(nèi)酯的合成及表
      人胎腦額葉和海馬中星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育性變化
      急性白血病免疫表型及陽性細(xì)胞比例分析
      南涧| 仁化县| 年辖:市辖区| 南丰县| 海晏县| 武陟县| 怀安县| 浦城县| 清远市| 崇礼县| 哈巴河县| 赣州市| 上思县| 芷江| 莱州市| 新田县| 禹州市| 双桥区| 瑞昌市| 无棣县| 牟定县| 南开区| 太谷县| 太原市| 伊春市| 安图县| 密山市| 达拉特旗| 长治县| 永兴县| 探索| 石嘴山市| 博湖县| 罗甸县| 湘潭县| 灌云县| 房产| 延长县| 山东省| 滦南县| 拉萨市|