孟順利張 力史兆國(guó)劉海霞韓大勇趙連娣王興國(guó)陳婷婷

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

混合菌株發(fā)酵麥秸生產(chǎn)蛋白飼料發(fā)酵條件的研究

孟順利2張 力1*史兆國(guó)2劉海霞1韓大勇1趙連娣2王興國(guó)1陳婷婷1

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

通過(guò)對(duì)綠色木霉、紅芝、酵母三菌共同發(fā)酵條件的研究確定最佳的發(fā)酵條件。試驗(yàn)首先進(jìn)行綠色木霉、紅芝共同發(fā)酵，再接種酵母進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料條件的研究。最終得出最優(yōu)方案為即綠色木霉、紅芝共同發(fā)酵8 d接種酵母，接種量5%，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度為28℃，培養(yǎng)基中真蛋白含量最高。

綠色木霉 紅芝 酵母 蛋白飼料

我國(guó)作為一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年產(chǎn)生大量的各種秸稈，而這部分秸稈只有不到10%用于飼料[1]，而其大部分被用于焚燒或者丟棄田間，這既造成了資源的浪費(fèi)又對(duì)環(huán)境造成了污染，隨著社會(huì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對(duì)環(huán)境污染問(wèn)題也更加關(guān)注和重視，所以怎樣提高秸稈的利用率成了亟待解決的問(wèn)題。而限制秸稈利用率的關(guān)鍵問(wèn)題是其含有大量的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，這些成分很難被機(jī)體消化吸收，因此導(dǎo)致了利用率低的問(wèn)題，所以要想解決這些問(wèn)題，還要從降低秸稈的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的角度出發(fā)。大量的國(guó)內(nèi)外學(xué)者也研究了不同的物理、化學(xué)的秸稈利用方法，但是都存在著秸稈利用不充分、成本高的問(wèn)題[2-4]。而研究表明木霉、曲霉、白腐真菌類能夠降解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，且成本較低。何桂霞[5]研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉和白腐真菌共同發(fā)酵秸稈其纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率分別達(dá)到41.6%、36.35%和51.9%。黃茜[6]研究發(fā)現(xiàn)利用平菇和康氏木霉進(jìn)行混合發(fā)酵在H6-T10的時(shí)候其降解秸稈效果最好，木質(zhì)素降解率達(dá)到44.77%，纖維素降解率達(dá)到41.48%。

近年來(lái)，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，飼料資源的不足日益嚴(yán)峻，因此很多學(xué)者都致力于纖維素酶和單細(xì)胞蛋白的研究，以更好地提高纖維素飼料的利用率[7-8]，單細(xì)胞蛋白營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，含有的氨基酸齊全且配比合理，除此之外還含有豐富的碳水化合物、脂類、維生素、礦物質(zhì)[9]。尤其是酵母中還含有植物性胰島素，多種酶和激素等活性物質(zhì)，可以促進(jìn)食欲和對(duì)養(yǎng)分的吸收利用提高生產(chǎn)率[10]，廖雪義等[11]利用木霉和酵母混合發(fā)酵秸稈生產(chǎn)蛋白飼料中，其發(fā)酵終產(chǎn)物中粗蛋白含量從4.2%提高到19.7%，粗纖維含量從36.2%下降到24.1%。王平[12]等利用米曲霉發(fā)酵玉米秸稈部分替代玉米飼喂雞，發(fā)現(xiàn)雞腸道中乳酸菌、米曲霉含量增加且大腸桿菌數(shù)量顯著降低。所以本研究利用綠色木霉、白腐真菌、酵母的特性，對(duì)麥秸進(jìn)行固體發(fā)酵，從綠色木霉、白腐真菌共同發(fā)酵時(shí)間、接種量、接種酵母后發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度四個(gè)方面，進(jìn)行發(fā)酵條件的篩選和優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

綠色木霉X-57、紅芝（由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)實(shí)驗(yàn)室保存），熱帶產(chǎn)朊假絲酵母（由廣東微生物菌種中心提供，江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：稱取去皮新鮮土豆200 g，切成小塊，加水至1 L，煮沸30 min。用紗布過(guò)濾后加20 g葡萄糖、20 g瓊脂粉，在電爐上加熱至瓊脂溶化，加水補(bǔ)足1 L[12]。分裝至已空消過(guò)的試管中，置滅菌鍋中121℃滅菌20 min。傾斜靜置，待凝固后備用。

綠色木霉液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，酵母膏10g，硫酸銨2.5 g，磷酸二氫鉀6 g，氯化鈣1 g，七水硫酸鎂0.8 g，碳酸鈣0.4 g，加水溶解定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至4.8。分裝入250 ml三角瓶中，裝液量為50 ml/瓶。121℃滅菌30 min。

紅芝液體種子液培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，煮沸30 min，紗布過(guò)濾，加入20 g蔗糖，融化后補(bǔ)水至1000 ml，自然pH值，加入10 g秸稈粉，100 ml分裝250 ml三角瓶，121℃間歇滅菌[13]。

YPD酵母菌種子液培養(yǎng)基：蛋白胨2%，葡萄糖2%，酵母膏1%，水95%，115℃滅菌30 min[14]。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麥秸粉350 g，麩皮150 g，溶于1 L水，自然pH值，硫酸銨10 g，磷酸二氫鉀2.5 g，碳酸鈣2.5 g，七水硫酸鎂1.25 g，氯化鈷0.5 g，充分?jǐn)嚢瑁盅b到250 ml三角瓶中，每瓶裝25 g，121℃滅菌60 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化

將保存的菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)7 d，再轉(zhuǎn)接，一般轉(zhuǎn)接活化2～3次，于4℃保存?zhèn)溆肹15]

1.2.2 種子液的制備

用接種環(huán)分別接種一環(huán)綠色木霉和紅芝接種在綠色木霉和紅芝液體種子培養(yǎng)基里面，在28℃分別培養(yǎng)3 d和5 d。

接種一環(huán)假絲酵母在YPD酵母菌種子液培養(yǎng)基里并在28℃培養(yǎng)20 h。

1.2.3 固體發(fā)酵

將發(fā)酵好的種子液按照綠色木霉和紅芝的體積比為1：3的比例分別接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 單因素接種酵母試驗(yàn)方法

1.2.4.1 酵母接種時(shí)間對(duì)固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響

在綠色木霉和紅芝發(fā)酵2 d、4 d、6 d、8 d、10 d時(shí)分別接種假絲酵母，酵母接種量（培養(yǎng)基：酵母的質(zhì)量體積比）為3%，發(fā)酵溫度為28℃，在發(fā)酵24 h時(shí)測(cè)定培養(yǎng)基的真蛋白含量。本試驗(yàn)共5個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.4.2 酵母接種量對(duì)固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響

在綠色木霉和紅芝發(fā)酵6天時(shí)，分別接種1%、3%、5%、7%、9%的酵母，發(fā)酵溫度為28℃，在發(fā)酵24 h時(shí)測(cè)定培養(yǎng)基的真蛋白含量。本試驗(yàn)共5個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.4.3 酵母發(fā)酵時(shí)間對(duì)固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響

在綠色木霉、紅芝共同發(fā)酵6 d，酵母接種量為3%，發(fā)酵溫度為28℃時(shí)，分別測(cè)定發(fā)酵12 h、24 h、36 h、48 h、60 h時(shí)固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白的含量。本試驗(yàn)共5個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.4.4 酵母發(fā)酵溫度對(duì)固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響

在綠色木霉、紅芝共同發(fā)酵6天，酵母接種量為3%，發(fā)酵時(shí)間為24h時(shí)，分別測(cè)定發(fā)酵溫度為22℃、25℃、28℃、31℃、34℃的情況下固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白的含量。本試驗(yàn)共5個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 多因素正交試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)合單因素影響的試驗(yàn)結(jié)果，選取其中對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量影響較大的因素，接種時(shí)間為4 d、6 d、8 d，接種量為3%、5%、7%，發(fā)酵時(shí)間為24 h、36 h、48 h，發(fā)酵溫度為25℃、28℃、31℃，進(jìn)行多因素共同作用下的L9（34）優(yōu)化組合正交試驗(yàn)，對(duì)不同因素水平組合條件下的真蛋白含量分別測(cè)定。本試驗(yàn)共9個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

表1 接種酵母發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.6 真蛋白含量的測(cè)定

將培養(yǎng)好的固體培養(yǎng)基進(jìn)行80℃烘干，測(cè)定其真蛋白含量，測(cè)定方法見(jiàn)張麗英主編[15]《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用軟件SPSS 19.0對(duì)單因素試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，對(duì)正交試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素接種酵母試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酵母接種時(shí)間對(duì)固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響結(jié)果

表2 不同接種時(shí)間對(duì)培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響

注：同列標(biāo)不同字母的表示差異顯著（P＜0.05），同列標(biāo)相同字母的標(biāo)志之間差異不顯著（P＞0.05）。

由表2可知隨著綠色木霉、紅芝發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，在相同條件下培養(yǎng)基中真蛋白的含量呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢(shì)，真蛋白含量最高是在發(fā)酵第8 d，達(dá)到8.855%，而且第8 d時(shí)與其他各組差異顯著（P＜0.05），最少是在第2 d，只有5.865%。

2.1.2 酵母接種量對(duì)固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響結(jié)果

表3 不同接種量對(duì)真蛋白含量的影響

由表3可知在其他條件相同的情況下，隨著酵母接種量的增加，培養(yǎng)基中真蛋白的含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，但是在接種量為5%及以后其真蛋白含量差異不再顯著（P＞0.05），最高是在接種9%，達(dá)到9.28%，在節(jié)約資源和成本的原則下選擇接種量為3%、5%、7%為最優(yōu)結(jié)果，再進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.3 酵母發(fā)酵時(shí)間對(duì)固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響結(jié)果

表4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)真蛋白含量的影響

由表4可知，在接種酵母后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中真蛋白的含量逐漸增加，在發(fā)酵60 h后達(dá)到最高值為10.41%，發(fā)酵36、48、60 h的時(shí)候其增加量逐漸降低，且在其之間真蛋白含量差異不顯著（P＞0.05），發(fā)酵12、24 h與其他各組之間差異都顯著（P＜0.05）。以節(jié)約時(shí)間成本考慮，選擇發(fā)酵24、36、48 h為最優(yōu)組別再進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.4 酵母發(fā)酵時(shí)間對(duì)固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響結(jié)果

表5 不同發(fā)酵溫度對(duì)真蛋白含量的影響

注：同列標(biāo)不同字母的表示差異顯著（P＜0.05），同列標(biāo)相同字母的標(biāo)志之間差異不顯著（P＞0.05）。

從表5中可以看出，隨著發(fā)酵溫度的增加，培養(yǎng)基中真蛋白含量先是逐漸增加，在28℃之后又逐漸降低，28℃時(shí)達(dá)到最高值為9.115%，與其他各組差異顯著（P＜0.05），也可以推斷出其最適溫度范圍為25℃～31℃，所以選擇25℃、28℃、31℃為最優(yōu)，再進(jìn)行優(yōu)化選擇。

表6 接種酵母正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 多因素正交試驗(yàn)結(jié)果

從表6中比較各個(gè)因素水平均值，求出每個(gè)因素的最大平均值，可以得出培養(yǎng)基的最優(yōu)方案。其最優(yōu)方案為A2B2C3D2，即接種時(shí)間為8 d，接種量5%，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度為28℃。通過(guò)分析，列出各個(gè)因素對(duì)指標(biāo)影響的大小進(jìn)行排序。從表6中可以看出，對(duì)真蛋白含量影響最大的是發(fā)酵時(shí)間，依次是發(fā)酵溫度、接種量、接種時(shí)間。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)綠色木霉、紅芝、酵母共同發(fā)酵培養(yǎng)條件的研究，進(jìn)行了單因素試驗(yàn)和多因素的正交試驗(yàn)，綜合了規(guī)?；囵B(yǎng)及實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中的成本考慮，最終得出最優(yōu)方案為綠色木霉、紅芝共同發(fā)酵8 d接種，接種量5%，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度為28℃，培養(yǎng)基中真蛋白含量最高。由于試驗(yàn)所用菌種是從外購(gòu)買，其各種產(chǎn)酶活性及各種生理生化指標(biāo)試驗(yàn)都需要進(jìn)一步進(jìn)行，這些工作有待于今后逐步研究。

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2014年省創(chuàng)新項(xiàng)目-發(fā)酵農(nóng)作物秸稈生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)粗飼料菌株的篩選與優(yōu)化研究 （項(xiàng)目編號(hào) 201412806001Y）

孟順利（1988-），男，在讀碩士，研究方向：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)。

劉海霞（1974-），女，副教授，研究方向：草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)方面的研究。