鄧春朋 王紅寧雷昌偉 張安云 張冬冬

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，“985工程”西南資源環(huán)境與災(zāi)害防治科技創(chuàng)新平臺(tái)，四川成都 610064）

雞源大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥性分析及相關(guān)耐藥突變研究

鄧春朋 王紅寧*雷昌偉 張安云 張冬冬

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，“985工程”西南資源環(huán)境與災(zāi)害防治科技創(chuàng)新平臺(tái)，四川成都 610064）

本試驗(yàn)采用藥敏紙片法對(duì)2014年從13 個(gè)不同規(guī)?；u場(chǎng)分離的135株雞源大腸桿菌進(jìn)行常用12種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明，頭孢西丁和阿莫西林/棒酸耐藥率較低，分別為17.8%、18.5%，而氟喹諾酮類(lèi)的環(huán)丙沙星、諾氟沙星和左氧氟沙星的耐藥率較高，分別為68.9%、65.2%和63.7%；進(jìn)一步對(duì)高耐藥率的氟喹諾酮類(lèi)耐藥菌株測(cè)定環(huán)丙沙星MIC值為4～256μg/ml；PCR擴(kuò)增相關(guān)耐藥基因（gyrA和parC），并測(cè)序分析耐藥決定區(qū)突變及與MIC對(duì)應(yīng)關(guān)系表明，耐藥菌株突變主要發(fā)生在gyrA基因的Ser83密碼子和Asp87密碼子，及parC基因的Ser80密碼子和Glu84密碼子上，不同突變類(lèi)型分別對(duì)應(yīng)一定MIC值范圍，其中73.1%（57/78）突變類(lèi)型為gyrA基因的C（Ser83）→T（Leu）和G（Asp87）→A（Asn）突變，及parC基因的G（Ser80）→T（Ile）突變，其MIC值在8～256μg/ml之間；本研究提示規(guī)?；u場(chǎng)在防治大腸桿菌等細(xì)菌病時(shí)，應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果選用藥物，少用或不用氟喹諾酮類(lèi)藥物。

雞源大腸桿菌 氟喹諾酮類(lèi)藥物 耐藥性 耐藥突變

由某些血清型的禽致病性大腸桿菌感染所引起的雞大腸桿菌病（Chicken colibacillosis），感染率、發(fā)病率、死亡率越來(lái)越高，已成為養(yǎng)雞業(yè)中最常見(jiàn)和防治困難的重要疾病之一，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1～3]。氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物，具有殺菌力強(qiáng)，抗菌譜廣，安全性好等特點(diǎn)，在我國(guó)畜禽疾病防治方面使用很廣[4]。隨著氟喹諾酮類(lèi)藥物的廣泛使用，大腸桿菌已成為規(guī)?；u場(chǎng)耐藥最嚴(yán)重的菌種之一[5]。

細(xì)菌氟喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(qū)點(diǎn)突變通常導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生[6]。研究表明，對(duì)大腸桿菌而言，gyrA基因的Ser83密碼子突變引起低度耐藥，在發(fā)生Asp87密碼子突變后導(dǎo)致較高程度耐藥[7]，而parC基因的Ser80密碼子和Glu84密碼子突變與高度耐藥密切相關(guān)[8]。

本研究為規(guī)?；u場(chǎng)有效防治大腸桿菌引起的發(fā)病提供藥物選擇和使用建議，及為氟喹諾酮類(lèi)突變耐藥的進(jìn)一步研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

MH培養(yǎng)基，伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB）；12種抗菌藥物：頭孢西丁、多粘菌素、阿米卡星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林/棒酸、慶大霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考，新霉素，頭孢他啶，頭孢噻呋；Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)；BIO-RAD S1000 Thermal Cycler PCR儀；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒；PrimeSTAR Max Premix（2×）。

1.2 菌株

試驗(yàn)菌株：135株雞源大腸桿菌分離自2014年，來(lái)源于13個(gè)不同規(guī)?；u場(chǎng)的病死雞、飼料、蛋品等162份樣品中。用接種環(huán)進(jìn)行無(wú)菌操作，挑取162個(gè)樣品劃線于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB）37℃培養(yǎng)18～24 h，再挑取表面光滑，邊緣整齊，長(zhǎng)有紫紅色或紫黑色帶有金屬光澤的小菌落，重復(fù)劃線培養(yǎng)1～2次，對(duì)于可疑菌落進(jìn)一步采用BD Phoenix?-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。通過(guò)鑒定，從162個(gè)樣品中共分離到135株雞大腸桿菌，分離率83.3%。質(zhì)控菌株：大腸桿菌ATCC25922購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.3 方法

1.3.1 藥物敏感性試驗(yàn)及MIC值測(cè)定

藥敏試驗(yàn)采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（the Clinical and Laboratory Institute，CLSI）推薦的K-B紙片法進(jìn)行[9]，以大腸桿菌ATCC25922作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株。

針對(duì)氟喹諾酮類(lèi)耐藥大腸桿菌進(jìn)一步采用瓊脂稀釋法測(cè)定環(huán)丙沙星（CIP）最小抑制濃度（Minimum Inhibitory Concentrations，MICs），按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

1.3.2 gyrA和parC基因氟喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(qū)PCR擴(kuò)增、測(cè)序及耐藥突變分析

按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明，提取菌株的基因組DNA模板，針對(duì)gyrA基因和parC基因的氟喹諾酮類(lèi)耐藥區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，gyrA-F：5′-TACACCGGTCAACATTGAGG-3′；gyrA-FR：5′- TTAATGATTGCCGCCGTCGG -3′；ParC -F：5′- GCGAATAAGTTGAGGAATC AG -3′；ParC -R：5′-AGCTCGGAATATTTCGACAAC -3′。按照PrimeSTAR Max Premix（2×）說(shuō)明，配置25μL PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件如下：98℃預(yù)變性2min；94℃變性15s，55℃～℃58退火5s，72℃延伸5s，35個(gè)循環(huán)；72℃，延伸2min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，使用凝膠成像系統(tǒng)照相確定產(chǎn)物，并將得到的gyrA和parC粗產(chǎn)物在低溫下送至生工生物工程（上海）股份有限公司純化后測(cè)序。

采用MEGA6生物分析軟件，對(duì)測(cè)序得到的gyrA和parC基因DNA序列和標(biāo)準(zhǔn)野生型菌株大腸桿菌ATCC15922的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，確定其和標(biāo)準(zhǔn)菌株的上述DNA序列完全吻合后，比對(duì)試驗(yàn)菌株的DNA序列，進(jìn)一步分析其突變位點(diǎn)和突變類(lèi)型。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗(yàn)及MIC值測(cè)定結(jié)果

12種常用抗生素的耐藥率檢測(cè)結(jié)果表明：頭孢西丁、阿莫西林/棒酸和阿米卡星耐藥率較低，分別為17.8%、18.5%和20.7%；氟喹諾酮類(lèi)的環(huán)丙沙星、諾氟沙星和左氧氟沙星的耐藥率較高，分別為68.9%、65.2%和63.7%。具體見(jiàn)表1。氟喹諾酮類(lèi)耐藥雞大腸桿菌的環(huán)丙沙星MIC值測(cè)定結(jié)果為4～256 μg/ml。

表1 135株雞源大腸桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 gyrA和parC基因氟喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(qū)測(cè)序結(jié)果及耐藥突變分析

2.2.1 gyrA和parC基因氟喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(qū)測(cè)序結(jié)果及分析

93株環(huán)丙沙星耐藥菌和大腸桿菌ATCC25922的氟喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(qū)測(cè)序結(jié)果表明：78株耐藥菌存在突變，突變耐藥率為83.9%（78/93），主要突變位點(diǎn)為gyrA基因的83位Ser密碼子和87位Asp密碼子，及parC基因的80位Ser密碼子和84位Glu密碼子；根據(jù)這些位點(diǎn)突變的情況，菌株耐藥突變類(lèi)型可分為9種（不含未突變類(lèi)型），其中73.1%的突變類(lèi)型為gyrA基因的C（Ser83）→T（Leu）和G（Asp87）→A（Asn）突變，及parC基因的G（Ser80）→T（Ile）突變，而標(biāo)準(zhǔn)野生型菌株的氟喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(qū)未發(fā)現(xiàn)突變。

2.2.2 耐藥菌株突變類(lèi)型與MIC值的對(duì)應(yīng)分析

菌株耐藥突變類(lèi)型與MIC值的對(duì)應(yīng)分析表明：發(fā)生gyrA基因的C（Ser83）→T（Leu）或TCG（Ser83）→ATG（Ile）突變僅引起菌株低度水平耐藥（MIC值＜16 μg/ml）；gyrA基因的C（Ser83）→T（Leu）和G（Asp87）→A（Asn）或C（Ala）突變，及parC基因的G（Ser80）→T（Ile）或G（Arg）AGC，或（Ser80）→ATT（Ile）突變類(lèi)型引起菌株中度水平耐藥（MIC＜128 μg/ml）；在中度水平耐藥菌株的突變基礎(chǔ)上，發(fā)生parC基因的A（Glu84）→G（Gly）或T（Val）突變則引起菌株高度水平耐藥（MIC≥128 μg/ml）。

3 討論

隨著氟喹諾酮類(lèi)藥物在我國(guó)畜禽養(yǎng)殖中的廣泛使用，特別是不科學(xué)、過(guò)量地濫用氟喹諾酮類(lèi)藥物，導(dǎo)致了細(xì)菌的耐藥性和藥物殘留等問(wèn)題日益突出。B.Stephan等人的研究表明歐洲國(guó)家2008年雞大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為55.6%[10]。目前，在美國(guó)，氟喹諾酮類(lèi)藥物已被禁止家禽生產(chǎn)中使用，在歐盟，盡管在家禽飼養(yǎng)中仍有可能使用，但也受到有一些限制[11]。而本研究中，我國(guó)規(guī)模化雞場(chǎng)雞源大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率高達(dá)68.9%。

在氟喹諾酮類(lèi)耐藥突變分析中，gyrA基因的C（Ser83）→T（Leu）和G（Asp87）→A（Asn）突變，及parC基因的G（Ser80）→T（Ie）突變類(lèi)型占突變耐藥菌總數(shù)的73.1%，說(shuō)明這可能是我國(guó)規(guī)?；u場(chǎng)環(huán)丙沙星耐藥大腸桿菌中流行的耐藥突變類(lèi)型，且此類(lèi)型菌株的環(huán)丙沙星MIC值在8～256μg/ml之間，說(shuō)明存在未知突變或其他因素影響菌株的耐藥性。

總之，本研究建議規(guī)模化雞場(chǎng)在防治大腸桿菌等細(xì)菌病時(shí)，應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果選用藥物，少用或不用氟喹諾酮類(lèi)藥物。

[1] 鄭志明，劉孟，李東明，金文杰，秦愛(ài)建.三株具有磷霉素抗性禽源大腸桿菌的分離鑒定及其MIC測(cè)定[J].中國(guó)家禽，2013，35（11）：20-22.

[2] 賀常亮.治療雞大腸桿菌病的中藥方劑篩選及其作用機(jī)理研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2011.

[3] 廖曉萍，岳 磊，曾振靈.禽源大腸桿菌耐藥現(xiàn)狀與防治對(duì)策[J].中國(guó)家禽，2008，30（6）：1-5.

[4] 朱僧，邢艷萍，胡騰.15株臨床分離耐藥大腸桿菌耐氟喹諾酮類(lèi)抗生素基因的檢測(cè)與序列分析[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，36（6）：875-879.

[5] Yu，X.，Susa，M.，Knabbe，C.，Schmid，R.D.，Bachmann，T.T.，Development and validation of a diagnostic DNA microarray to detect quinolone-resistant Escherichia coli among clinical isolates[J]. Journal of clinical microbiology，2004，42，4083-4091.

[6] Jacoby，G.A.Mechanisms of resistance to quinolones[J].Clinical infectious diseases，2005，41 Suppl 2，S120-126.

[7] Sáenz，Y.，Zarazaga，M.，Bri?as，L.，Ruiz-Larrea，F(xiàn).，Torres，C.Mutations in gyrA and parC genes in nalidixic acidresistant Escherichia coli strains from food products，humans and animals[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2003，51，1001-1005.

[8] Hopkins，K.L.，Davies，R.H.，Threlfall，E.J.Mechanisms of quinolone resistance in Escherichia coli and Salmonella[J].International journal of antimicrobial agents，2005，25，358-373.

[9] 譚 瑤，舒為群，陳 浩.K-B紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，7（20）：2290 - 2291.

[10] A.de Jong，B.Stephan，P.Silley.Fluoroquinolone resistance of Escherichia coli and Salmonella from healthy livestock and poultry in the EU[J].Journal of Applied Microbiology，2011，112，239-245.

[11] Vanni M，董曉云.家禽大腸桿菌喹諾酮耐藥決定區(qū)氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥性及gyrA和parC基因分子特性研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2014，（05），pp.93.

國(guó)家973重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃（2013CB127200）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（蛋雞）（CARS-41-K09）、四川省蛋雞產(chǎn)業(yè)鏈項(xiàng)目（2011NZ0073）、四川省肉雞產(chǎn)業(yè)鏈項(xiàng)目（2012NZ0037）、四川省科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)項(xiàng)目-動(dòng)物疫病防控與動(dòng)物產(chǎn)品安全（14010136）。

鄧春朋，男，碩士研究生，從事應(yīng)用微生物研究。

王紅寧，女，教授，博士生導(dǎo)師，從事動(dòng)物疾病防控、微生物基因工程研究。