李聽聽 陳 偉 李廣富 盧中一

(山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，泰安 271018)

全球每年約有25%的農(nóng)作物被真菌毒素污染，約2%的農(nóng)作物因污染嚴重而失去營養(yǎng)和經(jīng)濟價值，造成數(shù)千億美元的經(jīng)濟損失［1－2］。玉米屬于不耐儲品種，在儲藏期間會受到各種微生物特別是霉菌的危害，尤其在高濕高溫的環(huán)境下，霉菌生長旺盛，其分泌的毒素對人體有很強的致癌作用。因此，防止真菌污染和真菌毒素是糧食儲藏過程中最關(guān)鍵的問題之一［3］。

玉米赤霉烯酮(ZEN)是由玉米赤霉菌、串珠鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌等真菌所產(chǎn)生的真菌毒素，造成的危害僅次于黃曲霉毒素［4］。ZEN主要污染玉米、小麥、大麥、燕麥等農(nóng)作物及動物飼料。ZEN是具有雌激素作用的真菌毒素［5］。玉米中檢測到ZEN濃度高達11.88 mg/kg，在燕麥、小麥、大麥和高粱中也廣泛檢出 ZEN［6］。我國 GB2715—2005《糧食衛(wèi)生標準》規(guī)定小麥和玉米中的ZEN不得超過60 μg/kg。

本試驗設(shè)定不同的相對濕度和水分含量，對玉米儲藏中的霉菌數(shù)量、類群及玉米赤霉烯酮含量進行測定，并分析糧食儲藏過程中ZEN含量與霉菌數(shù)量及類群間的關(guān)系，先使用Shannon指數(shù)(H)、Margalef豐富度指數(shù)(D)和Pielou均勻度指數(shù)(E)來評價霉菌群落遺傳多樣性分析，最后用SAS v9.0軟件進行顯著性分析，從而確定不同相對濕度儲藏環(huán)境下，優(yōu)勢霉菌活動差異性、ZEN產(chǎn)量差異性及相關(guān)性。旨在為更好的糧食儲藏提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 玉米原料

岱玉D4收獲于2013年10月份，購買自泰安市農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 儀器

TC－512 PCR擴增儀:上海創(chuàng)萌生物科技有限公司;美國Bio－Rad伯樂變性凝膠電泳儀(DGGE):上?？蠌妰x器有限公司;GelDoc 2000凝膠成像儀:北京乾明基因技術(shù)有限公司。

1.1.3 試驗試劑

真菌培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基，察氏培養(yǎng)基，孟加拉紅培養(yǎng)基［7］。

PCR－DGGE試劑:真菌基因組DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.TMHP Fungal DNA Kit，OMEGA):北京全式金生物技術(shù)有限公司;2×Taq MasterMix(with dye):北京康為世紀生物科技有限公司;Tris(Solarbio)、Na2EDTA·2H2O(Sigma)、去離子甲酰胺(Solarbio)、TE(Solarbio):北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米含水量調(diào)節(jié)［8］

將初始含水量12.1%的玉米調(diào)節(jié)至12.4%、14.3%、15.9%、17.6%、19.9%5 個梯度［9］。將清理的玉米分5等份，每份約5 kg，置于塑料容器中，采用噴霧方法，加入不同量的無菌水，按其含水量計算調(diào)節(jié)至目標含水量所需的理論添加無菌水量，用噴霧器分3次將理論添加無菌水量的蒸餾水噴到糧食表面，邊噴邊攪拌，以保證著水的均勻。著水后的玉米放置塑料袋內(nèi)，排出袋中空氣，密封于冰箱4℃冷藏保存，平衡24 h。

1.2.2 模擬儲藏

干燥器(180 mm)內(nèi)放置不同飽和鹽溶液，以形成不同相對濕度的密閉環(huán)境。分別以NaCl、KNO3和KCl的飽和鹽溶液配置在30℃形成75%、84%、92%不同的相對濕度［10］。將稱取的玉米樣品500 g分別放在無菌透氣保鮮袋內(nèi)，將保鮮袋放在裝有不同飽和鹽溶液的干燥器內(nèi)，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(見表1)。

表1 模擬儲藏的15個處理組

1.2.3 玉米霉菌菌落計數(shù)及分離與鑒定

參照國標食品衛(wèi)生微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)(GB 4789.15—2010)。玉米中霉菌的分離及鑒定參照GB/T 4789.16、中國真菌志第五卷“曲霉屬及相關(guān)有性型”執(zhí)行［11］。

1.2.4 高效液相色譜法(HPLC)測定玉米赤霉烯酮

1.2.4.1 玉米赤霉烯酮的提取和凈化［12］

提取:準確稱取10 g玉米粉于250 mL錐形瓶中，加入40 mL 乙腈 －水 －乙酸(84∶15∶1，V/V)溶液并混勻，超聲30 min，期間混勻1次，然后置于振蕩器上振蕩30 min，再用濾紙過濾，收集濾液。

凈化:移取8.0 mL濾液過免疫親和柱Mycosep 226柱凈化，準確轉(zhuǎn)移4 mL凈化液于試管中。

衍生:將試管放于60℃水浴氮氣吹干，后加200μL正己烷和100μL三氟乙酸，塞上塞子，放在40℃的水浴鍋中衍生20 min。

定容:將衍生后的樣品溶液放在60℃水浴氮氣吹干，加入1 mL甲醇－水(1∶1，V/V)溶液定容，在渦旋機上渦旋1 min后，倒入10 mL注射器中過0.22 μm的有機PTFE濾膜，待測。

1.2.4.2 玉米赤霉烯酮標準溶液的配制與柱前衍生

吸取黃曲霉毒素標準溶液200μL，在60℃水浴下氮氣吹干，衍生化方法同1.2.4.1。

1.2.4.3 液相色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm，5μm，日本島津)。流動相:A為含1%的磷酸溶液:B 為乙腈(55∶45，V/V)流速:0.35 mL/min;進樣量:20μL;柱溫:30℃;熒光檢測器:激發(fā)波長235 nm，發(fā)射波長460 nm。

1.2.4.4 玉米赤霉烯酮的換算公式y(tǒng)=(0.067 9x－0.175 6)×(40/4)×100×10－3式中:y為每kg玉米中所含玉米赤霉烯酮的量ug/kg;x為峰面積。

1.2.5 玉米真菌遺傳多樣性測定

1.2.5.1 DGGE變性凝膠電泳

1)玉米上真菌總DNA的提取。采用OMEGA(E.Z.N.A.TMHP Fungal DNA Kit)試劑盒，具體按照試劑盒說明書進行。

2)真菌的ITS區(qū)段進行PCR反應。以1)中提取的DNA為模板，反應體系為50∶2μL 10μM ITS1－F－GC(5'－CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCT TGG TCA TTT AGA GGA AGT AA－3')(下劃線部分為 GC clamp)［13］，2 μL 10 μM ITS2 － R(5'－ TGT GTT CTT CAT CGA TG－3')，PCR Mix預混液25 μL，dd H2O 19μL。擴增程序:94℃預變性5 min，20個循環(huán)(94℃變性1 min;65～0.5℃退火45 s;72℃延伸1 min)，15個循環(huán)(94℃變性1 min;55℃退火45 s;72℃延伸1.5 min)，最終72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3)將各處理3平行PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司Cycle－Pure Kit試劑盒回收純化為50μL，具體步驟參照說明書進行。

4)采用Bio－Rad公司Dcode型梯度膠制備裝置，制備變性劑濃度從30%～60%的8%聚丙烯酰胺凝膠。待膠凝固后，加入 PCR產(chǎn)物45μL和10×Loading Buffer 15μL的混合物，在1×TAE緩沖液中，50 V預跑30 min，然后150 V電泳6 h。

5)電泳結(jié)束后將凝膠放在DuRed核酸染液(泡染法)染色40～50 min。采用UVP(Gel Doc－It Imaging System)成像系統(tǒng)拍照，并用(Bio－Rad)軟件進行圖像分析。

1.2.5.2 DGGE部分條帶測序

使用TIANGEN公司ZeroBack Fast Ligation Kit及DH5α感受態(tài)細胞進接合結(jié)合轉(zhuǎn)化，提交條帶測序在華大基因測序。采用MEGA5.1對測序結(jié)果進行分析。序列提交到 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)的BLAST程序進行同源性比較。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

使用 Shannon指數(shù)(H)、Margalef豐富度指數(shù)(D)和Pielou均勻度指數(shù)(E)來評價細菌群落遺傳多樣性，其計算公式為:

式中:Pi為某一條帶的強度與同泳道中所有條帶總強度的比值，即Pi=ni/N;S為每一泳道總的條帶數(shù)［14］。數(shù)據(jù)處理和分析采用SASv9.0軟件。

2 結(jié)果和分析

2.1 玉米赤霉烯酮標準曲線方程及樣品的初始濃度

ZEN濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性回歸方程y=0.067 9x－0.175 6，相關(guān)系數(shù)0.996 1。檢測樣品初始質(zhì)量濃度為24.89μg/kg

圖1 玉米赤霉烯酮的標準曲線

2.2 不同儲藏環(huán)境下霉菌總數(shù)，木霉、串珠鐮刀菌數(shù)量與玉米赤霉烯酮含量

2.2.1 RH 75%環(huán)境下

玉米在溫度30℃RH 75%的環(huán)境中儲藏28 d，隨玉米初始水分含量增加，串珠鐮刀菌呈上升趨勢，霉菌菌量、木霉菌量和玉米赤霉烯酮的含量均呈先升后降的趨勢(表2)。霉菌和木霉均在初始水分含量為15.9%處取得最大菌落數(shù)，ZEN在初始水分含量14.3%處有最大毒素含量，是初始毒素量的11.40倍。當玉米中的水分含量超過14.3%，串珠鐮刀菌數(shù)量大幅度增加，而ZEN積累量開始逐漸下降?？赡茉蛴?，一是此時環(huán)境不適合ZEN的產(chǎn)生，即產(chǎn)毒菌株產(chǎn) ZEN的能力下降;二是霉菌中其他菌［15－16］，尤其是木霉［17］均能通過細胞壁吸附、產(chǎn)生某種降解ZEN的物質(zhì)和營養(yǎng)競爭作用等多種方式抑制了鐮刀菌生長、產(chǎn)毒及增強了玉米上毒素的降解能力。也進一步說明，并不是鐮刀菌的數(shù)量越多，產(chǎn)生毒素的量就越多，鐮刀菌產(chǎn)毒是多種因素共同作用的結(jié)果。

表2 RH 75%不同水分含量霉菌總數(shù)、木霉、串珠鐮刀菌與玉米赤霉烯酮的量

2.2.2 RH 84%環(huán)境下

在溫度30℃RH 84%的環(huán)境下不同含水量的玉米經(jīng)過28 d的儲藏后，隨著玉米中初始水分含量的增加，木霉量和ZEN的積累量呈逐漸上升趨勢，霉菌量和串珠鐮刀菌呈相同的波浪起伏式趨勢(表3)。且都在初始水分含量19.9% 時取得相對較大值，且ZEN的量是初始值的11.44倍。

表3 RH 84%不同水分含量霉菌總數(shù)、木霉、串珠鐮刀菌與玉米赤霉烯酮的量

2.2.3 RH 92%環(huán)境下

在溫度30℃RH 92%的環(huán)境下不同含水量的玉米經(jīng)過28 d的儲藏后(表4)，隨著玉米水分的增加，霉菌總量和木霉量都呈先上升后下降的趨勢，且在15.9%處取得最大值，此時ZEN含量也是初始值51.30倍;ZEN積累量與串珠鐮刀菌量的變化有相同的趨勢，均在19.9%處取得最大值，且ZEN是初始值的95.28倍，說明高濕度的環(huán)境下利于ZEN的產(chǎn)生，這與參考文獻［18－20］中的研究結(jié)果相一致。

表4 RH 92%不同水分含量霉菌總數(shù)，木霉、串珠鐮刀菌與玉米赤霉烯酮的量

經(jīng)單因素方差分析，在RH 75%和92%、溫度30℃的環(huán)境下，經(jīng)過28 d儲藏后，玉米中霉菌量、木霉量和ZEN積累量均有顯著性差異(P＜0.05)，串珠鐮刀菌無顯著性差異(P＞0.05);在RH 84%、溫度30℃下，除了串珠鐮刀菌有顯著性差異(P＜0.05)，其余均無顯著性差異(P＞0.05)。

綜上所述，霉菌在中高濕度環(huán)境下更易生長和產(chǎn)毒。串珠鐮刀菌會在高濕度環(huán)境下產(chǎn)生ZEN，產(chǎn)毒量隨初始水分含量升高而增加。在低濕度環(huán)境下，初始水分對木霉抑制ZEN的影響明顯，抑制效果隨初始水分升高而迅速增加;在中高濕度環(huán)境下，木霉對ZEN的抑制效果更強，且受初始水分影響較小。

2.3 玉米儲藏期間霉菌多樣性變化

通過 DGGE－PCR方法對在 RH 75%、84%、92%溫度30℃玉米儲藏28 d真菌群落進行測定，DGGE電泳結(jié)果如圖2所示。在RH 92%環(huán)境下，樣品水分含量12.4%和14.3%的霉菌豐富度較高，高濕度高水分含量的樣品10(RH 92%，水分含量19.9%)菌群很單一，豐富度低。

處理6(RH 92%、含水量12.4%)和處理7(RH 92%、含水量14.3%)多樣性指數(shù)最高，豐富度指數(shù)較高，而高濕度高水分含量的處理10(RH 92%，含水量19.9%)多樣性和豐富度相對較低(表5)。再次論證了由圖2得出的結(jié)論。

綜上分析可知，水分和環(huán)境濕度是菌落生長的重要因素，也是菌源的豐富度的重要決定因子，但菌群豐富度并不是與相對濕度或水分含量絕對正相關(guān)，而是每個樣品的最佳菌群豐富度都有一個適宜的相對濕度和水分含量。

選擇15個處理樣品中亮度比較明顯的條帶(1～19共19條)進行測序比對(表6)。比對結(jié)果與已發(fā)表序列的相似性達到91%～100%，19條帶共測定出12個序列，其中有4個序列為未培養(yǎng)菌類，占到總序列數(shù)的33.3%;其中黃曲霉和黑曲霉各占2個序列，均占到總序列數(shù)的16.7%;鐮刀菌占1個序列，占總序列數(shù)的8.3%。

圖2 玉米霉菌ITS區(qū)的DGGE分離

表5 儲藏玉米霉菌多樣性、豐富度及均勻度指數(shù)變化

表6 測序及比對結(jié)果

2.4 相關(guān)性分析

經(jīng)相關(guān)性分析表明:在溫度30℃，不同含水量的玉米經(jīng)過28 d的儲藏后，在RH 75%的環(huán)境下，玉米中的霉菌總量、木霉、串珠鐮刀菌數(shù)量和水分含量均與ZEN的積累量呈負相關(guān)。在RH 92%的環(huán)境下，28 d的霉菌總量、串珠鐮刀菌、木霉數(shù)量和水分含量均與ZEN的積累量呈正相關(guān);且玉米中鐮刀菌數(shù)與 ZEN積累量呈顯著正相關(guān)(P＜0.05，k=0.902);在RH 84%的環(huán)境下，經(jīng)過28 d儲藏，木霉量和水分含量與ZEN積累量呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，玉米中鐮刀菌數(shù)和霉菌總數(shù)與ZEN積累量呈負相關(guān);在3種儲藏環(huán)境下，儲藏玉米霉菌的多樣性指數(shù)(H)和豐富度指數(shù)(D)均與ZEN積累量呈顯著性負相關(guān)(P＜0.05)。

綜上3個不同的儲藏環(huán)境相關(guān)性的分析，在中、低濕度環(huán)境下，玉米上的鐮刀菌數(shù)與ZEN量呈現(xiàn)明顯負相關(guān)性，這說明在中低濕度環(huán)境下，ZEN的積累量生物因素和環(huán)境因素的影響較大。在高濕度環(huán)境下，玉米上鐮刀菌與ZEN呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性，即ZEN積累量主要是由鐮刀菌數(shù)為主導，而受其他霉菌影響相對較少。

表7 ZEN與串珠鐮刀菌、木霉、霉菌及水分間相關(guān)性

3 結(jié)論

3.1 玉米在RH 75%的環(huán)境中串珠鐮刀菌數(shù)量最大的初始含水量是15.9%，產(chǎn)毒最多的玉米初始水分含量卻是14.3%，其毒素量是初始毒素量的11.40倍;玉米在RH 84%和92%的環(huán)境中串珠鐮刀菌數(shù)量和產(chǎn)毒量最大的初始含水量均是19.9%，其毒素積累量分別是初始毒素量的11.44倍和95.28倍。在低濕度環(huán)境下，初始水分對木霉數(shù)量抑制ZEN含量的效果隨初始水分升高而迅速增強;在中高濕度環(huán)境下，木霉對ZEN的抑制效果更強，且受初始水分影響較小。

3.2 RH 92%，含水量12.4%和14.3%的霉菌類群較多，即菌豐富度高，含水量19.9%時菌群豐富度低。經(jīng)相關(guān)性分析，在RH 75%的環(huán)境下，玉米中的霉菌總數(shù)、木霉、串珠鐮刀菌數(shù)量和水分含量均與ZEN的積累量呈負相關(guān);在RH 92%的環(huán)境下，均呈正相關(guān);在RH 84%的環(huán)境下，木霉數(shù)量和水分含量與ZEN積累量呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，鐮刀菌和霉菌總量與ZEN積累量呈負相關(guān);在3種儲藏環(huán)境下，儲藏玉米霉菌的多樣性指數(shù)(H)和豐富度指數(shù)(D)均與ZEN積累量呈顯著性負相關(guān)(P＜0.05)。

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