石龍凱 劉玉蘭

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocabons，PAHs)是一大類廣泛存在的環(huán)境污染物［1］，并且普遍具有致畸、致癌和致突變作用［2］。由于油料種子的遷移作用以及不當(dāng)?shù)挠椭庸l件致使多環(huán)芳烴可能會(huì)進(jìn)入食用油脂中，對(duì)消費(fèi)者的身體健康造成損害。歐盟No 835/2011規(guī)定［1］，食用油和脂肪(可可脂和椰子油除外)中苯并(a)芘的限量為不超過(guò)2 μg/kg，苯并(a)蒽、屈、苯并(b)熒蒽、苯并(a)芘等 4種多環(huán)芳烴(PAH4)的總限量為不超過(guò)10μg/kg。我國(guó)GB2716—2005《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》僅規(guī)定苯并(a)芘限量為不超過(guò)10μg/kg，對(duì)其它多環(huán)芳烴并未做出限量規(guī)定。根據(jù)多環(huán)芳烴化合物的存在情況及致癌性，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署將16種多環(huán)芳烴化合物列為“優(yōu)先控制污染物”即EPA16，以求更加全面的反映和監(jiān)測(cè)多環(huán)芳烴化合物在環(huán)境及食品中的污染水平。雖然多環(huán)芳烴在食用油脂中的含量極低，然而，鑒于食用油脂在人們每日膳食中的普遍性和必要性，油脂中多環(huán)芳烴的含量水平值得高度關(guān)注并作為監(jiān)控指標(biāo)。

目前，對(duì)油脂中多環(huán)芳烴的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法有GB/T 22509—2008《動(dòng)植物油脂 苯并(a)芘的測(cè)定反相高效液相色譜法》、GB/T 24893—2010《動(dòng)植物油脂多環(huán)芳烴的測(cè)定》(高效液相色譜法)、GB/T 23213—2008《植物油中多環(huán)芳烴的測(cè)定氣相色譜－質(zhì)譜法》等。常用的檢測(cè)方法是HPLC－FLD法［3－5］和 GC －MS法［6－8］。在上述方法中，HPLC 法不能夠?qū)λ械哪繕?biāo)物進(jìn)行檢測(cè)，因?yàn)樗鼈冎杏行┪镔|(zhì)(如苊烯)的熒光吸收很弱，不能夠用熒光檢測(cè)器進(jìn)行定量分析。GC－MS法對(duì)某些低分子量熱穩(wěn)定性較差的多環(huán)芳烴檢測(cè)效果較差，且脂類物質(zhì)易在氣相系統(tǒng)的進(jìn)樣口、毛細(xì)管柱及離子源積聚，增加了基線噪音，影響儀器分析性能，同時(shí)，檢測(cè)目標(biāo)物較多時(shí)，單次分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(40～50 min)。劉玉蘭等［9］已經(jīng)建立了一種LC－MS/MS法檢測(cè)食用油脂中苯并(a)芘的快速、靈敏度高的方法，但該方法的研究當(dāng)時(shí)僅針對(duì)苯并(a)芘的檢測(cè)，未涉及食用油脂中其他多環(huán)芳烴成分的檢測(cè)。

本研究建立了一種有機(jī)溶劑萃取、硅膠固相萃取柱凈化、內(nèi)標(biāo)法定量、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(LCMS/MS)測(cè)定食用油脂中EPA 16種多環(huán)芳烴的檢測(cè)方法。與常規(guī)的HPLC－FLD法和GC－MS方法相比，本方法分析時(shí)間短，選擇性以及靈敏度高，適合于食用油脂中多環(huán)芳烴的定量分析，檢測(cè)結(jié)果能更加全面、準(zhǔn)確地反映食用油脂中多環(huán)芳烴各組分的含量水平。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

7類(40份)市售食用油脂:自購(gòu)。包括菜籽油4份、大豆油8份、橄欖油5份、花生油4份、葵花籽油4份、玉米油5份以及芝麻油10份。

EPA 16種多環(huán)芳烴混標(biāo)(200μg/mL，98%，溶解于乙腈):O2si公司;16種氘代同位素內(nèi)標(biāo)(97%):Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司;乙腈、甲苯及環(huán)己烷(色譜純):Sigma公司;硅膠固相萃取小柱:Supelco公司;超純水，Milli－Q超純水機(jī)制取。

1.2 試驗(yàn)儀器

安捷倫1200型液相色譜儀，配有G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G131lA四元混合泵和G1316A柱溫箱:美國(guó)安捷倫公司;API 5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有光電離離子源(APPI)和Analyst 1.5.1軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng):美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;日立L－2130泵:日本日立高新技術(shù)公司。

1.3 分析方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

EPA 16種多環(huán)芳烴混標(biāo)用乙腈稀釋20倍作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，各目標(biāo)物濃度為10μg/mL，工作液由儲(chǔ)備液梯度稀釋獲得，目標(biāo)物最終濃度為100 ng/mL。16種氘代內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液溶解于乙腈，各內(nèi)標(biāo)物濃度為1μg/mL。所有的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備于棕色瓶中，置于4℃保存。目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍為0.5 ng/mL～1μg/mL之間。按照優(yōu)化的液相和質(zhì)譜條件分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物濃度/內(nèi)標(biāo)物的濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物峰面積/內(nèi)標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品前處理

稱取1±0.01 g油脂樣品于15 mL塑料離心管中，加入60μL內(nèi)標(biāo)混合液及8 mL乙腈，以2 000 r/min震蕩9 min，接著以6 000 r/min離心3 min，上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，整個(gè)萃取過(guò)程再重復(fù)1次，合并2次的萃取液。萃取液蒸干后溶解于2 mL環(huán)乙烷，上樣于事先用環(huán)己烷平衡好的硅膠固相萃取小柱。以8 mL環(huán)己烷淋洗小柱，收集上樣液與洗脫液，氮吹至干，復(fù)溶于200μL乙腈，取5μL上樣分析。

1.3.3 回收率和精密度試驗(yàn)

取均一的油脂樣品，分為3組，構(gòu)成高中低3個(gè)加標(biāo)組及1個(gè)空白對(duì)照組。加標(biāo)水平分別為0.05、2、10μg/kg，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算回收率。以上選取的高中低3個(gè)加標(biāo)水平的油脂樣品，在同一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定其含量5次，計(jì)算日內(nèi)精密度;在連續(xù)6 d內(nèi)每天測(cè)定其含量3次，計(jì)算日間精密度。均以RSD表示。

1.4 色譜－質(zhì)譜條件

色譜條件:液相色譜柱，Agilent Zorbax Eclipse PAH柱(2.1 mm × 100 mm，3.5μm);柱溫箱，25℃;流動(dòng)相A，乙腈;流動(dòng)相 B，水;流速，0.4 mL/min;進(jìn)樣量，5μL;摻雜劑，甲苯;流速，100 μL/min;梯度洗脫，流動(dòng)相 A的比例:0～5 min，45%;5～15 min，45%～100%;15～21 min，100%;21～22 min，100%～45%。

質(zhì)譜條件:離子源電壓800 V;離子源溫度650℃;氣簾氣10 psi;碰撞氣7 psi;霧化氣80 psi;輔助加熱氣60 psi;駐留時(shí)間50 ms;離子模式，正離子模式。16種多環(huán)芳烴及其內(nèi)標(biāo)物離子對(duì)及碰撞能見表1。

表1 EPA 16種多環(huán)芳烴及氘代內(nèi)標(biāo)物的離子對(duì)及碰撞能

1.5 健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)［1］

采用苯并(a)芘的毒性當(dāng)量(toxic equivalent quantity，TEQ)，計(jì)算EPA 16種多環(huán)芳烴的毒性當(dāng)量TEQB(a)P。規(guī)定以苯并(a)芘為標(biāo)準(zhǔn)參考物，其毒性當(dāng)量因子(TEF)值為1，將其它多環(huán)芳與等量的苯并(a)芘對(duì)比毒性大小，得出各個(gè)多環(huán)芳烴的TEF值，TEQB(a)P的計(jì)算公式如下:

式中:Ci為第i個(gè)多環(huán)芳烴的質(zhì)量濃度，ng/kg;TEQB(a)P為基于苯并(a)芘的毒性當(dāng)量，ng/kg;TEFi為第i個(gè)多環(huán)芳烴對(duì)應(yīng)的TEF值。

2 結(jié)果和討論

2.1 方法的線性關(guān)系及檢出限

在選定的色譜和質(zhì)譜分析條件下對(duì)1.3.1中的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析。線性方程和相關(guān)系數(shù)由analysit 1.5.1軟件給出，所有目標(biāo)物都能保持好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 2～0.999 9。檢出限由3倍信噪比得來(lái)，定量限為10倍信噪比。EPA 16種多環(huán)芳烴檢出限和定量限分別為0.006～0.129μg/kg和0.02～0.43μg/kg。表2給出了EPA 16種多環(huán)芳烴的線性關(guān)系及檢出限和定量限。

2.2 回收率及精密度

在試驗(yàn)方法條件下，EPA 16種多環(huán)芳烴的回收率在86.5%～104.6%，日內(nèi)精密度小于6%，日間精密度小于5%，表明方法對(duì)食用油分析具有良好的精密度和重復(fù)性，具體分析測(cè)定結(jié)果見表3。

表2 EPA 16種多環(huán)芳烴的線性關(guān)系及檢出限和定量限

2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

利用建立的LC－MS/MS檢測(cè)方法，對(duì)所采集的7類(40份)食用油脂中的EPA 16種多環(huán)芳烴的含量進(jìn)行了測(cè)定。油脂樣品中目標(biāo)物色譜圖見圖1?？梢钥闯?，使用建立的前處理方法及分析，油脂樣品中的三酰甘油以及其他干擾物質(zhì)都被很好地去除，色譜柱以及選擇離子的使用能夠使同分異構(gòu)體以及其他共存物很好的基線分離。同時(shí)，氘代內(nèi)標(biāo)的使用，使定量結(jié)果更加可靠。

由表4可知，40份油脂樣品中EPA 16種多環(huán)芳烴的均值為 52.39μg/kg，含量范圍為 11.68～146.06μg/kg。其中輕質(zhì)多環(huán)芳烴是食用油脂中主要的多環(huán)芳烴污染物，占總量的80%以上，均值為43.88μg/kg，范圍為9.67～119.35μg/kg。所有目標(biāo)物中菲的污染程度最高，平均樣本含量為9.95 μg/kg，其次是熒蒽和芘，平均樣本含量分別為5.83 μg/kg和5.01μg/kg。二苯并(a，h)蒽的污染程度最低，平均含量為0.35μg/kg。受測(cè)油樣中，雖然輕質(zhì)多環(huán)芳烴的總量是重質(zhì)多環(huán)芳烴總量的5.3倍，但是重質(zhì)多環(huán)芳烴的TEQB(a)P值卻是輕質(zhì)多環(huán)芳烴的13.1倍。主要原因在于重質(zhì)多環(huán)芳烴的潛在致癌性高于輕質(zhì)多環(huán)芳烴，其TEF值是輕質(zhì)多環(huán)芳烴的100～1 000倍。同時(shí)也說(shuō)明食用油脂中重質(zhì)多環(huán)芳烴的致癌風(fēng)險(xiǎn)更強(qiáng)，對(duì)食用消費(fèi)者的危害性更大。

表3 方法的回收率和精密度/%

圖1 油脂樣品中EPA 16種多環(huán)芳烴色譜圖

苯并(a)芘作為食用油脂的重要衛(wèi)生指標(biāo)，在40份油脂樣品中的平均含量為1.35μg/kg，含量范圍為0.12～4.72μg/kg，低于 GB 2716—2005規(guī)定的10μg/kg限量值。但是在40份油脂樣品中，有8份樣品苯并(a)芘含量高于2μg/kg，按歐盟標(biāo)準(zhǔn)不合格率為20%。有10份樣品的PAH4含量高于10 μg/kg，按歐盟標(biāo)準(zhǔn)不合格率為25%。

表4 40份食用油脂中多環(huán)芳烴的存在情況

由于不同油料的油脂生產(chǎn)工藝不同，成品食用油脂中多環(huán)芳烴的分布情況也有所不同。由表5可知，7類食用油脂中，花生油和芝麻油是多環(huán)芳烴污染較為嚴(yán)重的2類油脂，而大豆油和葵花籽油中多環(huán)芳烴的污染程度最低?？偠喹h(huán)芳烴污染水平為:花生油＞芝麻油＞橄欖油＞菜籽油＞玉米油＞葵花籽油＞大豆油。究其原因，可能是在花生油和芝麻油的生產(chǎn)過(guò)程中，為使產(chǎn)品有濃香風(fēng)味，油籽往往要經(jīng)過(guò)高溫焙炒，過(guò)度的焙炒會(huì)使毛油中多環(huán)芳烴的含量增加。同時(shí)，為了保留在高溫焙炒過(guò)程中產(chǎn)生的香味，濃香型花生油和芝麻油的精煉通常只采用沉降和冷濾，而不經(jīng)過(guò)水化脫膠、堿煉脫酸、吸附脫色和水蒸氣蒸餾脫臭等精煉過(guò)程，這就可能使多環(huán)芳烴因不能被高效脫除而殘存在成品油脂中。菜籽油、大豆油、玉米油、葵花籽油的精煉一般都要經(jīng)過(guò)完整的精煉過(guò)程，因此，這些油的多環(huán)芳烴含量是比較低的。其結(jié)果見表5。

堿煉脫酸、吸附脫色和水蒸氣蒸餾脫臭被公認(rèn)為是脫除多環(huán)芳烴的有效手段［10－11］。劉玉蘭等［9］的研究發(fā)現(xiàn)，油脂堿煉過(guò)程對(duì)于苯并(a)芘的脫除有一定作用。張小濤等［12－13］研究發(fā)現(xiàn)，油脂的吸附脫色過(guò)程也能脫除苯并(a)芘，活性炭尤其是Norit活性炭對(duì)苯并(a)芘的脫除效果顯著好于活性白土及其他吸附劑。水蒸氣蒸餾脫臭能有效脫除油脂中的輕質(zhì)多環(huán)芳烴［14］。因此，為了降低食用油脂中多環(huán)芳烴的含量水平，合理的制油工藝和完善的精煉工序都是必不可少的。

3 結(jié)論

本研究建立了一種有機(jī)溶劑萃取、硅膠固相萃取柱凈化、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(LC－MS/MS法)測(cè)定食用油脂中EPA 16種多環(huán)芳烴的檢測(cè)方法。該方法前處理簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，靈敏度高。EPA 16種多環(huán)芳烴的定量限為0.02～0.43μg/kg，平均回收率范圍為86.5%～104.6%。對(duì)40份油樣的檢測(cè)結(jié)果顯示，EPA 16種多環(huán)芳烴的均值為52.39μg/kg，含量范圍為11.68～146.06μg/kg。苯并(a)芘的平均含量為1.35μg/kg，范圍為0.12～4.72μg/kg。對(duì)照我國(guó)GB 2716—2005規(guī)定，所有受測(cè)樣品中苯并(a)芘含量均不超過(guò)≤10μg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)。但8個(gè)油樣的苯并(a)芘含量超過(guò)了歐盟≤2μg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)，10個(gè)油樣的PAH4含量水平超過(guò)歐盟≤10μg/kg限量標(biāo)準(zhǔn)。輕質(zhì)多環(huán)芳烴的含量(范圍為9.67～119.35μg/kg)遠(yuǎn)高于重質(zhì)多環(huán)芳烴(范圍為1.27～26.71μg/kg)，但重質(zhì)多環(huán)芳烴的潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)更大。多環(huán)芳烴各組分中，菲、熒蒽、芘三者的污染最為嚴(yán)重，二苯并(a，h)蒽的污染水平最低。7類受測(cè)油脂樣品中，EPA 16種多環(huán)芳烴平均含量依次為花生油＞芝麻油＞橄欖油＞菜籽油＞玉米油＞葵花籽油＞大豆油，其差別可能主要與油脂制取和油脂精煉工藝及條件有關(guān)。從總體來(lái)看，雖然食用油中苯并芘含量超標(biāo)率較低，但多環(huán)芳烴總量及風(fēng)險(xiǎn)更應(yīng)受到重視，建議我國(guó)有關(guān)機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)食用油中多環(huán)芳烴的檢測(cè)和監(jiān)管力度，規(guī)定多環(huán)芳烴的限量指標(biāo)，確保食用油脂的品質(zhì)安全。

表5 不同種類食用油脂中多環(huán)芳烴的存在情況

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