旱稻成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素

李朝煒　劉穎　朱昀　劉青　賈慧敏

摘要：以旱稻品種鯤旱1號(hào)的種子為材料，研究了不同培養(yǎng)基成分及不同濃度的激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響。結(jié)果表明，NB培養(yǎng)基較MS培養(yǎng)基更加有利于旱稻愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)；當(dāng)2，4-D濃度為2 mg/L時(shí)的愈傷組織出愈率最高；添加脯氨酸不利于鯤旱1號(hào)愈傷組織的形成和生長(zhǎng)；選用麥芽糖作為碳源可明顯提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。

關(guān)鍵詞：旱稻；愈傷組織；成熟胚；誘導(dǎo)

中圖分類(lèi)號(hào)： Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0052-03

收稿日期：2014-03-17

基金項(xiàng)目：國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：2011ZX08001-003）。

作者簡(jiǎn)介：李朝煒（1979—），女，河北衡水人，博士，講師，從事植物基因工程與分子生物學(xué)研究。Tel：（0311）81668495；E-mail：lizhaowei79@163.com。旱稻是適于在旱地種植的栽培稻，屬于水稻的變異型，栽培歷史悠久，可追溯至數(shù)千年前，目前在世界范圍內(nèi)種植面積大約占到稻米總種植面積的12%。旱稻具有耐瘠、耐旱、適應(yīng)性廣的特點(diǎn)，在目前我國(guó)水資源短缺及耕地面積不斷減少的嚴(yán)峻形勢(shì)下具有明顯的發(fā)展優(yōu)勢(shì)。干旱缺水已成為制約我國(guó)糧食生產(chǎn)的關(guān)鍵性因素[1]，我國(guó)人均占有水資源量只有世界人均占有量的四分之一。水稻作為我國(guó)重要的糧食作物，其用水量巨大，加之現(xiàn)有選育和推廣的栽培稻品種普遍存在不抗旱的不足，因而水資源短缺已經(jīng)成為嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量的原因之一。在此形勢(shì)之下，加快選育旱稻新品種，能夠節(jié)約大量農(nóng)業(yè)用水，擴(kuò)大稻谷種植面積，增加糧食產(chǎn)出渠道，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益[2]。大力發(fā)展旱稻品種選育，獲得抗逆、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的旱稻品種，既可以克服干旱對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的危害，又為培育優(yōu)質(zhì)的稻類(lèi)新品種提供重要的基礎(chǔ)。通過(guò)基因工程的方法對(duì)其進(jìn)行改良是目前的研究熱點(diǎn)[3-8]。胚性愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化體系的最常用受體材料，其誘導(dǎo)條件成為稻類(lèi)組織培養(yǎng)研究的重要方面。本研究以粳水稻、粳旱稻、爪哇稻進(jìn)行三交雜交育種得到的耐旱高產(chǎn)的粳旱稻品種——鯤旱1號(hào)的成熟種子作為材料，研究在不同培養(yǎng)基成分及不同外源激素濃度配比情況下，旱稻愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)及誘導(dǎo)效率的差異，以期獲得大量適于遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)質(zhì)愈傷組織，并為進(jìn)一步建立穩(wěn)定高效的旱稻轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

旱稻品種鯤旱1號(hào)（由河北鯤鵬種業(yè)提供）的成熟種子作為愈傷組織誘導(dǎo)的材料。

1.2方法

1.2.1愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以NB培養(yǎng)基（N6大量元素、B5 微量元素、有機(jī)元素、鐵鹽）和MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，再添加一定濃度的激素及適量谷氨酰胺、水解酪蛋白、脯氨酸和蔗糖或麥芽糖等成分。將培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5.8，滅菌后倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿，待凝固后備用。

1.2.2種子滅菌選取適量籽粒飽滿(mǎn)、干凈無(wú)霉變的旱稻種子，脫去穎殼，放置在干凈離心管中，先用清水洗2遍，隨后在超凈臺(tái)上操作，加入適量75%的乙醇振蕩消毒1 min，然后棄去液體，再加入有效氯濃度為5%的次氯酸鈉溶液和幾滴吐溫20，滅菌2次，每次20 min，期間不斷劇烈振蕩，隨后棄去液體，用無(wú)菌水清洗5～6次，轉(zhuǎn)入無(wú)菌的三角瓶中浸泡20～30 min，再用無(wú)菌水清洗3～5次，將種子撈出，置于放有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中吸干水分。

1.2.3愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代待種子基本干燥之后，用滅菌的小勺或鑷子將種子均勻分布在不同成分的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每一個(gè)培養(yǎng)皿放置15～20粒，用封口膜將培養(yǎng)皿封好，置于28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。培養(yǎng)3～4 d后種子變得松軟，可見(jiàn)愈傷組織明顯形成，此時(shí)可將胚乳部分切去。待培養(yǎng)至7～10 d 時(shí)，愈傷組織長(zhǎng)至綠豆粒大小，此時(shí)將長(zhǎng)出的芽切去，再繼續(xù)培養(yǎng)至30 d左右。

1.2.4試驗(yàn)結(jié)果分析統(tǒng)計(jì)接種后每隔3～4 d觀察 1 次，如有污染的種子及時(shí)清除。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)出愈率：出愈率=（產(chǎn)生愈傷組織的種子粒數(shù)/接種的種子粒數(shù)）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)基成分對(duì)旱稻愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響

旱稻品種鯤旱1號(hào)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)分別采用NB和MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，采用麥芽糖作為碳源并添加適量激素。結(jié)果顯示，這2種培養(yǎng)基在接種4～5 d后均有愈傷組織開(kāi)始長(zhǎng)出，但誘導(dǎo)效率存在明顯差異，以NB培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)時(shí)，旱稻的愈傷誘導(dǎo)效率要高于以MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)時(shí)的愈傷誘導(dǎo)效率（表1）。此外，這2種培養(yǎng)基所誘導(dǎo)出的愈傷組織的狀態(tài)也存在差異。NB培養(yǎng)基上的愈傷組織顏色淡黃，顆粒較為致密且形態(tài)圓潤(rùn)，繼代之后生長(zhǎng)狀態(tài)良好；MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的愈傷組織顏色較為暗淡，顆粒松散干癟，且繼代之后容易褐化。由試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，在使用相同外源激素的情況下，培養(yǎng)基對(duì)鯤旱1號(hào)的愈傷組織出愈率及生長(zhǎng)狀態(tài)的影響較大。

2.2不同質(zhì)量濃度激素對(duì)旱稻愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

在誘導(dǎo)植物組織或器官產(chǎn)生愈傷的過(guò)程中，植物激素是影響誘導(dǎo)效率的重要因素[4]。本研究分別試驗(yàn)了在培養(yǎng)基中添加不同濃度的2，4-D和6-BA，結(jié)果（表2）顯示，在 NB

作為基礎(chǔ)成分的培養(yǎng)基上，2，4-D濃度為2.0 mg/L、6-BA 濃度為0 mg/L 時(shí)鯤旱1號(hào)成熟種子誘導(dǎo)愈傷組織的效率最高，達(dá)到77.3%；而2，4-D濃度為1.0 mg/L、6-BA濃度為1.0 mg/L 時(shí)出愈率最低，為36%。將2，4-D的濃度提高到4.0 mg/L時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率仍然較高，但愈傷組織的結(jié)構(gòu)變得較為細(xì)碎，不適于后續(xù)的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（結(jié)果未顯示），因此在本研究中2，4-D使用濃度以2 mg/L為宜，濃度過(guò)高或過(guò)低都不利于旱稻愈傷組織的誘導(dǎo)與生長(zhǎng)。此外，從表2可以看出，2，4-D是誘導(dǎo)旱稻愈傷所必需的因子，而添加 6-BA 對(duì)于鯤旱1號(hào)的愈傷誘導(dǎo)并無(wú)明顯促進(jìn)作用，當(dāng)濃度較大時(shí)反而有一定的抑制效果。

2.3脯氨酸對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在一些植物進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)添加脯氨酸可提高愈傷的出愈率和生長(zhǎng)速率并減少褐化[9-11]。因此在本研究中以NB培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，分別添加不同濃度的外源脯氨酸，每種處理接入100粒種子，27 ℃暗培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷的誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)狀況。隨后每種處理再分別接入50塊愈傷進(jìn)行繼代培養(yǎng)，10 d和20 d后分別統(tǒng)計(jì)褐化率，結(jié)果（表3）顯示，在進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)時(shí)添加較低濃度的脯氨酸（500 mg/L）并沒(méi)有明顯改善旱稻愈傷的誘導(dǎo)率和褐化率，當(dāng)脯氨酸添加濃度達(dá)到 1 000 mg/L 及以上時(shí)，反而對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)造成不利影響。不添加脯氨酸時(shí)愈傷組織為淡黃色，顆粒致密，生長(zhǎng)狀況良好，而添加較高濃度脯氨酸時(shí)誘導(dǎo)出的愈傷組織顏色呈現(xiàn)土黃色，且繼代后容易褐化。

2.4不同碳源對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響

糖類(lèi)作為植物組織培養(yǎng)的常用碳源，具有調(diào)節(jié)代謝、促進(jìn)生長(zhǎng)的重要作用[12]。其中蔗糖一直被廣泛應(yīng)用于多種植物的組織培養(yǎng)，隨著研究領(lǐng)域的不斷拓展，其他糖類(lèi)對(duì)植物組織培養(yǎng)的效應(yīng)引起廣泛關(guān)注。研究表明不同植物對(duì)不同糖類(lèi)的反應(yīng)有所差異，蔗糖并不是針對(duì)所有植物材料組織培養(yǎng)的最佳碳源。

近年來(lái)，利用麥芽糖作為碳源對(duì)植物組織培養(yǎng)的影響效果受到重視。本研究以NB培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，比較了蔗糖和麥芽糖分別作為碳源時(shí)愈傷的生長(zhǎng)狀態(tài)，結(jié)果見(jiàn)表4。當(dāng)以蔗糖作為碳源時(shí)，誘導(dǎo)出的愈傷出愈率較低，顏色較為暗淡，將碳源換為麥芽糖時(shí)，出愈率較高，愈傷為淡黃色且狀態(tài)良好。

3結(jié)論與討論

3.1激素配比對(duì)旱稻愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

不同稻類(lèi)的基因型差異是影響其愈傷誘導(dǎo)和遺傳轉(zhuǎn)化效率的重要因素[5]，以往研究結(jié)果顯示，不同旱稻品種的愈傷誘導(dǎo)體系和效率差異較大[11，13-15]，并且由于針對(duì)旱稻的研究成果較少，與水稻相比試驗(yàn)難度較大。為獲得狀態(tài)良好的愈傷組織，為今后進(jìn)一步建立高效遺傳轉(zhuǎn)化體系建立基礎(chǔ)，本研究針對(duì)鯤旱1號(hào)成熟種子的適宜愈傷誘導(dǎo)條件進(jìn)行了摸索。結(jié)果顯示，NB培養(yǎng)基較MS培養(yǎng)基更為適宜旱稻的愈傷誘導(dǎo)；2，4-D作為生長(zhǎng)素的一種類(lèi)似物，是用于誘導(dǎo)植物形成愈傷組織的常用激素，其使用濃度過(guò)低或過(guò)高均不利于愈傷生成，本研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L的2，4-D即可使愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到最高；6-BA作為第一個(gè)人工合成的細(xì)胞分裂素，具有多種生理作用，相關(guān)研究證實(shí)其在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)常與2，4-D配比使用，具有一定的效果，其使用濃度一般多為0.5 mg/L至1.5 mg/L[15-17]，本研究結(jié)果顯示添加 0.5 mg/L 的6-BA對(duì)于鯤旱1號(hào)的愈傷誘導(dǎo)并無(wú)明顯促進(jìn)作用，當(dāng)濃度較大時(shí)（1.0～1.5 mg/L）反而有一定的抑制效果。

3.2脯氨酸對(duì)旱稻愈傷組織的影響

有研究顯示脯氨酸在植株生理代謝及細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)過(guò)程中起重要作用，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加適量濃度的脯氨酸能夠增強(qiáng)愈傷組織的代謝活力，促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)[9-11]。而本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中添加一定濃度脯氨酸時(shí)，對(duì)旱稻的愈傷誘導(dǎo)和抑制褐化并未有明顯的改善效果，并且加入脯氨酸后形成的愈傷組織為土黃色，質(zhì)地較為細(xì)碎干癟且容易褐化，不適于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化，分析其原因，可能與旱稻和水稻在細(xì)胞內(nèi)源性游離脯氨酸含量、細(xì)胞膜通透性等方面的差異有關(guān)[18]。脯氨酸在組織培養(yǎng)體系中的具體作用原理尚不十分明確，它對(duì)植物愈傷組織生長(zhǎng)的促進(jìn)效應(yīng)是否具有普遍性還有待進(jìn)一步研究。

3.3不同碳源對(duì)旱稻愈傷組織的影響

碳源是培養(yǎng)基中不可缺少的必要成分，以糖類(lèi)作為碳源，不僅能夠?yàn)榧?xì)胞提供能量，還可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓，因此被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)。不同的糖類(lèi)其具體生理效應(yīng)也不相同，選擇合適的糖類(lèi)作為碳源，能夠更好地促進(jìn)培養(yǎng)物生長(zhǎng)，是植物組織培養(yǎng)體系的重要影響因素之一[19-20]。

麥芽糖與蔗糖分子量相同，均為二糖，是植物組織培養(yǎng)體系常用碳源。在針對(duì)鯤旱1號(hào)的愈傷誘導(dǎo)研究中，麥芽糖作為碳源，對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效果要優(yōu)于蔗糖，其原因可能是多方面的，例如其分解速度慢于蔗糖，可使培養(yǎng)物保持相對(duì)穩(wěn)定的滲透壓；也有可能是旱稻組織細(xì)胞對(duì)麥芽糖的利用能力要好于蔗糖?？傊?，不同植物進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)最適用的糖類(lèi)并不相同，在具體研究中需要進(jìn)行針對(duì)性的探索。

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