木霉菌分離培養(yǎng)基的優(yōu)化及對(duì)黃萎病的拮抗篩選

劉政　孫艷　張學(xué)坤　陳兵

摘要：為了確定適合從土壤中分離木霉菌的培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)5種不同的組合配方，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，土壤稀釋10倍后用改良的PDA+0.15 g/L孟加拉紅培養(yǎng)基分離土壤，能夠減少菌落重疊，使菌落容易辨別，適合木霉菌的分離；經(jīng)過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)，篩選出4株對(duì)棉花黃萎病具有拮抗作用的木霉菌，分別為T(mén)1、T10、T25、T34，其生長(zhǎng)速率分別是棉花黃萎病菌的7.89、7.92、7.87、7.76倍。

關(guān)鍵詞：木霉菌；培養(yǎng)基；黃萎病菌；拮抗篩選

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.621.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0121-03

收稿日期：2014-03-17

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31360452、41161068）；兵團(tuán)技術(shù)轉(zhuǎn)移項(xiàng)目（編號(hào)：2012BD057）；兵團(tuán)青年創(chuàng)新基金（編號(hào)：2011CB001）。

作者簡(jiǎn)介：劉政（1979—），男，安徽阜陽(yáng)人，碩士，助理研究員，主要從事棉花病害生物防治方面的研究。Tel：（0993）6683537；E-mail：lzh8200@126.com。土壤是微生物生存的大本營(yíng)，木霉菌是土壤中普遍存在的一類(lèi)真菌，屬于半知菌類(lèi)絲孢目叢梗孢科木霉屬（Trichoderma spp.）[1]。它可以產(chǎn)生一些抗生物質(zhì)并寄生在其他真菌上[2-3]，與其他微生物形成空間或營(yíng)養(yǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[4-6]，能夠抑制或降解某些病原物為侵入植物而分泌的果膠酶和其他酶類(lèi)的合成[7]；此外，還與植物建立協(xié)同共生的關(guān)系，并能誘導(dǎo)植物抗性、激發(fā)植物防御反應(yīng)機(jī)制等[8]。目前，木霉菌作為生物防治的優(yōu)勢(shì)菌在植病生防中的應(yīng)用潛力越來(lái)越受到重視，而木霉菌在從土壤分離培養(yǎng)的過(guò)程中因土壤微生物種類(lèi)較多、群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，極易漏篩掉優(yōu)良的木霉菌株，所以選擇適合木霉菌分離的培養(yǎng)基非常關(guān)鍵。本研究設(shè)計(jì)5種不同配方的培養(yǎng)基和不同的稀釋濃度，利用新疆兵團(tuán)棉花黃萎病嚴(yán)重發(fā)病的土壤為研究材料，找到適合木霉菌分離的培養(yǎng)基和稀釋濃度，篩選出拮抗性強(qiáng)的木霉菌并研究其對(duì)棉花黃萎病菌的拮抗作用，為今后從土壤中大批量地篩選木霉菌提供一套可行的方法，同時(shí)篩選獲得的木霉菌株為今后開(kāi)展小區(qū)試驗(yàn)和田間試驗(yàn)提供基礎(chǔ)條件。

1材料與方法

1.1木霉菌分離培養(yǎng)基的配制

1.1.1木霉菌基礎(chǔ)分離培養(yǎng)基（1）PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g、葡萄糖30.0 g、瓊脂20.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min備用。（2） TSM培養(yǎng)基。K2HPO4 0.9 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、KCl 0.15 g、NH4NO3 1.0 g、葡萄糖3.0 g、孟加拉紅0.15 g、60%敵克松可濕性粉劑0.3 g、五氯硝基苯（PCNB） 0.2 g、瓊脂20.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL ，121 ℃滅菌20 min，用之前加入100 mg/L氯霉素。

1.1.2木霉菌改良分離培養(yǎng)基設(shè)置TSM培養(yǎng)基、TSM培養(yǎng)基+0.08 g/L三唑酮、PDA+0.15 g/L孟加拉紅、PDA+015 g/L孟加拉紅+0.2 g/L PCNB、PDA+0.15 g/L孟加拉紅+0.2 g/L PCNB+0.08 g/L三唑酮5種培養(yǎng)基。

1.2木霉菌分離培養(yǎng)基和稀釋濃度的篩選

采集來(lái)自于不同地區(qū)的10份土樣，用以上5種培養(yǎng)基分離木霉菌，設(shè)置3個(gè)稀釋濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，根據(jù)分離篩選結(jié)果，選出最佳分離培養(yǎng)基和稀釋濃度。

稀釋平板法：稱(chēng)取土樣10 g，放入裝有90 mL滅菌蒸餾水及小玻璃珠的250 mL三角瓶中，在搖床上以120 r/min搖 10 min，使土樣充分分散，即成10-1倍稀釋液；再吸取攪拌中的10-1倍稀釋液1 mL移入裝有9 mL滅菌蒸餾水的試管中，即成10-2倍稀釋液；依此制成10-3倍稀釋液（注意：每次一定要更換試管，連續(xù)稀釋?zhuān)?。將融化的選擇性培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿倒入15 mL。待培養(yǎng)基冷卻成平板后，用無(wú)菌吸管按無(wú)菌操作過(guò)程分別吸取土樣的10-3稀釋液0.1 mL，于分離時(shí)用在培養(yǎng)基平板上，再用無(wú)菌刮鏟將稀釋液涂勻后培養(yǎng)，每個(gè)稀釋濃度重復(fù)3次，置于培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)，待72 h后觀察菌落，選定特征菌落，挑菌絲于新培養(yǎng)平板上培養(yǎng)。

1.3木霉菌株拮抗作用的初步研究

1.3.1平板對(duì)峙拮抗試驗(yàn)[9]將待測(cè)木霉菌與棉花黃萎病菌同步活化后，棉花黃萎病菌提前7 d接種于PDA平板上對(duì)峙培養(yǎng)，然后在黃萎病菌落對(duì)面接種木霉菌，平板直徑為 90 mm，兩菌間接種距離為50 mm，3 d后觀察營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)情況，隨后每天觀察有無(wú)重寄生現(xiàn)象或抑菌現(xiàn)象，并記錄拮抗情況。

1.3.2拮抗優(yōu)勢(shì)菌株與棉花黃萎病的生長(zhǎng)速率觀察將培養(yǎng)好的黃萎病菌和木霉菌打成直徑均為5 mm的菌餅，分別接入直徑為70、200 mm的PDA培養(yǎng)皿中心，置于27 ℃培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，每天測(cè)量菌落直徑，連續(xù)觀察5 d后結(jié)束，比較木霉菌和黃萎病菌的生長(zhǎng)速率。

2結(jié)果與分析

2.1木霉菌分離培養(yǎng)基和稀釋倍數(shù)的篩選

培養(yǎng)基中PCNB對(duì)絲核菌及部分放線菌有抑制效果；孟加拉紅對(duì)細(xì)菌有廣譜抑制作用；適量的三唑酮能刺激孢子萌發(fā)，增加分生孢子產(chǎn)量，有效抑制輪枝菌生長(zhǎng)；TSM培養(yǎng)基本身含有氯霉素、孟加拉紅、敵克松、PCNB等多種抑菌成分。

由表1可知，稀釋濃度為10-1 的PDA+0.15 g/L孟加拉紅培養(yǎng)基中分離出的微生物數(shù)量較多，個(gè)別為細(xì)菌，絕大多數(shù)為木霉菌等真菌，易鑒別，有利于挑取菌絲、單孢分離等操作。而其他配方培養(yǎng)基和稀釋濃度的分離效果均不理想，因此，選擇稀釋濃度為10-1 的PDA+0.15 g/L孟加拉紅培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行本試驗(yàn)中木霉菌分離培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)分離得到了38株木霉菌菌株。表1細(xì)菌培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

培養(yǎng)基配方稀釋濃度菌落生長(zhǎng)情況TSM培養(yǎng)基10-1分離出的微生物數(shù)量很多，菌落重疊嚴(yán)重，大部分為細(xì)菌，少量為木霉等真菌10-2分離出的微生物數(shù)量較多，菌落重疊嚴(yán)重，大部分為細(xì)菌，個(gè)別為木霉等真菌10-3分離出的微生物數(shù)量較少，多數(shù)為細(xì)菌，木霉菌等真菌數(shù)量少TSM培養(yǎng)基+0.08 g/L三唑酮10-1分離出的微生物數(shù)量很多，菌落重疊嚴(yán)重，大部分為細(xì)菌，少量為木霉等真菌10-2分離出的微生物數(shù)量較少，多數(shù)為細(xì)菌，木霉菌等真菌數(shù)量少10-3分離出的微生物數(shù)量極少，多數(shù)為細(xì)菌，個(gè)別為木霉菌等真菌PDA+0.15 g/L孟加拉紅10-1分離出的微生物數(shù)量較多，個(gè)別為細(xì)菌，絕大多數(shù)為木霉菌等真菌，有易于鑒別，利于挑取菌絲、單孢分離等操作10-2分離出的微生物數(shù)量極少，大量木霉菌等被抑制，無(wú)法分離出來(lái)10-3只分離出個(gè)別真菌微生物，木霉菌等幾乎全部被抑制，無(wú)法分離出來(lái)PDA+0.15 g/L孟加拉紅+0.2 g/L10-1分離出的微生物數(shù)量較多，菌落重疊嚴(yán)重，大部分為細(xì)菌，少部分為木霉等真菌PCNB10-2只分離出個(gè)別微生物，大量微生物無(wú)法分離出來(lái)10-3幾乎無(wú)法分離出微生物PDA+0.15 g/L孟加拉紅+0.2 g/L 10-1分離出的微生物數(shù)量很多，菌落重疊嚴(yán)重，大部分為細(xì)菌，個(gè)別為木霉等真菌PCNB+0.08 g/L三唑酮10-2分離出的微生物數(shù)量較多，菌落重疊嚴(yán)重，大部分為細(xì)菌，少量為木霉等真菌10-3分離出的微生物數(shù)量較少，多數(shù)為細(xì)菌，木霉菌等真菌數(shù)量少，無(wú)法分離出來(lái)

2.2木霉菌株拮抗作用的初步研究

木霉菌對(duì)棉花黃萎病菌的拮抗作用主要有營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、重寄生作用、抗生作用。經(jīng)過(guò)對(duì)峙拮抗篩選發(fā)現(xiàn)，木霉菌株T1、T10、T25、T34具有明顯的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)和重寄生作用，具體結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，提前7 d接種棉花黃萎病菌，可讓黃萎病菌落生長(zhǎng)至一定的菌落大小，然后在其對(duì)側(cè)接種木霉菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種木霉菌生長(zhǎng)速度很快，能快速占據(jù)生存空間和爭(zhēng)奪養(yǎng)分，而棉花黃萎病菌生長(zhǎng)速度較慢，且受到明顯的抑制，因?yàn)槟久咕霓卓棺饔贸丝臻g競(jìng)爭(zhēng)作用外，還有重寄生作用和溶菌作用。

2.3拮抗優(yōu)勢(shì)菌株與棉花黃萎病的生長(zhǎng)速率觀察

由圖2可知，將木霉菌T1與棉花黃萎病菌H5-1同時(shí)接入PDA培養(yǎng)基后，木霉菌生長(zhǎng)迅速，初期菌絲為白色，3 d后出現(xiàn)同心輪紋狀現(xiàn)象，5 d后幾乎布滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)皿，其菌落直徑是棉花黃萎病菌的7.89倍。

將篩選出來(lái)的木霉菌T10、T25、T34生長(zhǎng)速率與棉花黃萎病菌H5-1進(jìn)行比較，也表現(xiàn)出木霉菌生長(zhǎng)速率很快而黃萎病菌生長(zhǎng)速率緩慢的現(xiàn)象，到培養(yǎng)后5 d時(shí)，各菌株的生長(zhǎng)速率分別是棉花黃萎病菌的7.92、7.87、7.76倍。

3小結(jié)

土壤中微生物種類(lèi)多，如果不選擇合適的培養(yǎng)基則很難從土壤中分離出各種木霉。因此，分別以TSM培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)5種不同配方的木霉菌培養(yǎng)基，來(lái)篩選分離木霉菌的最適培養(yǎng)基和最佳稀釋濃度。TSM培養(yǎng)基本身含有氯霉素、孟加拉紅、敵克松、PCNB等多種抑菌成分，具有較強(qiáng)的抑菌效果，對(duì)木霉菌也產(chǎn)生了一定的抑制作用，分離效果不佳；選用的孟加拉紅+PDA 培養(yǎng)基減少了菌落重疊，使菌落容易辨別，根據(jù)稀釋濃度來(lái)看，發(fā)現(xiàn)稀釋10倍有利于木霉菌株的分離，因此最后確定土壤稀釋10倍后用改良的PDA+0.15 g/L孟加拉紅培養(yǎng)基能達(dá)到最佳分離效果，將得到的木霉菌株進(jìn)一步進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，從而得到4株分離純化的木霉菌。

在本試驗(yàn)中，木霉菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)和空間具有強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)能力，對(duì)病原菌的拮抗作用表現(xiàn)為生長(zhǎng)迅速并覆蓋黃萎病菌，纏繞在菌絲體上，使黃萎病菌菌落塌陷、解體分離等現(xiàn)象，說(shuō)明4種木霉菌對(duì)棉花黃萎病菌都有一定程度的拮抗作用；進(jìn)一步考察其生長(zhǎng)速率，發(fā)現(xiàn)木霉菌菌落生長(zhǎng)繁殖擴(kuò)散很快，5 d后的生長(zhǎng)速率是黃萎病菌的7～8倍，這可能是因?yàn)槟久咕诙唐趦?nèi)大量繁殖，吸收大量的營(yíng)養(yǎng)，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)來(lái)拮抗黃萎病菌，從而達(dá)到防控棉花黃萎病的效果。不過(guò)土壤中微生物群落復(fù)雜，土壤中pH值、腐植酸和其他各種因子對(duì)木霉菌影響很大，單純的平板對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果并不能完全反映木霉菌對(duì)棉花黃萎病的實(shí)際防治效果，因此獲得的拮抗木霉菌株在田間的防治效果還有待進(jìn)一步研究。

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