朱愛榮+霍如林+張林+高峰+周光宏

摘要：為了制備可用于檢測(cè)氟苯尼考的特異性多克隆抗體，采用戊二醛法合成氟苯尼考的人工抗原FFA-BSA、FFA-OVA、紫外分光光度計(jì)進(jìn)行鑒定，用FFA-BSA免疫BALB/C雌性小鼠獲得可用于檢測(cè)氟苯尼考的特異性多克隆抗體，并用間接ELISA法對(duì)其進(jìn)行特異性鑒定。結(jié)果顯示：經(jīng)過紫外掃描鑒定，成功合成了人工抗原合 FFA-BSA 和FFA-OVA，偶聯(lián)比分別為12 ∶1和11 ∶1。制備的抗體效價(jià)低于1 ∶32 000，抑制率為50%（IC50）時(shí)的氟苯尼考濃度為36.9 ng/mL?？梢?，本試驗(yàn)制備的氟苯尼考多克隆抗體具有較好的親和力和高特異性，有良好的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：氟苯尼考；人工抗原；BALB/C雌性小鼠；多克隆抗體

中圖分類號(hào)： S859.79+6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0201-04

收稿日期：2014-03-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2012BAD28B03）；江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項(xiàng)目[編號(hào)：SX（2011）146]。

作者簡(jiǎn)介：朱愛榮（1990—），女，安徽宣城人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與畜產(chǎn)品品質(zhì)研究。Tel：（025）84399007；E-mail：2011105044@njau.edu.cn。

通信作者：高峰，教授，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與畜產(chǎn)品品質(zhì)研究。Tel：（025）84399007；E-mail：gaofeng0629@ sina.com。氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)F）別稱氟甲砜霉素，具有抗菌廣譜、吸收速度快、體內(nèi)分布廣、無潛在性再生障礙性貧血等優(yōu)點(diǎn)[1]，因此，氟苯尼考被廣泛使用在水產(chǎn)、畜禽養(yǎng)殖中，用于防治動(dòng)物的感染性疾病[2]。然而，在動(dòng)物生產(chǎn)中，氟苯尼考的不規(guī)范使用和濫用導(dǎo)致其在動(dòng)物食品中產(chǎn)生殘留，進(jìn)而對(duì)消費(fèi)者健康構(gòu)成潛在威脅，產(chǎn)生血液系統(tǒng)毒性[3]和胚胎毒性[4]；動(dòng)物用藥后甚至?xí)霈F(xiàn)短暫的厭食、腹瀉和炎癥等不良反應(yīng)[3-4]，因此，國(guó)內(nèi)外相繼規(guī)定了氟苯尼考在動(dòng)物性食品中的最高殘留限量[2]。目前，關(guān)于氟苯尼考的檢測(cè)方法較多，主要包括高效液相色譜法[5-6]、氣相色譜法[7]、氣質(zhì)聯(lián)用[8]、液質(zhì)聯(lián)用[9-10]和免疫學(xué)方法[11-12]等。理化分析法對(duì)操作人員要求苛刻，需要昂貴的設(shè)備，樣品前處理時(shí)間長(zhǎng)，不適合大批量樣品的篩選；而免疫學(xué)方法相對(duì)簡(jiǎn)單、快速和經(jīng)濟(jì)；膠體金免疫層析技術(shù)是以膠體金為標(biāo)記物的免疫層析方法，具有攜帶方便、操作簡(jiǎn)單、特異敏感、成本低、不需儀器或僅需簡(jiǎn)單儀器、肉眼下幾分鐘即可觀察到試驗(yàn)結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[13-14]。制備好的抗體是免疫學(xué)檢測(cè)的前提條件。氟苯尼考是小分子物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1，分子量為358.22，本身沒有免疫原性，目前還未見到關(guān)于氟苯尼考的快速檢測(cè)試紙條的報(bào)道。本試驗(yàn)通過氟苯尼考的改造體氟苯尼考胺與載體蛋白相偶聯(lián)合成人工抗原，并用人工抗原免疫小鼠獲得高特異性抗體，為研制快速檢測(cè)氟苯尼考?xì)埩舻哪z體金免疫層析試紙條奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料6周齡BABLB/C雌性小鼠，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2主要試劑含量>98.0%的氟苯尼考胺；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、卵清白蛋白（OVA）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、TMB，Sigma-Aldich公司；含量>98.0%的牛血清白蛋白（BSA），Amresco公司；DMF（N，N-二甲基甲酰胺）、戊二醛等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

PBS緩沖液（pH值 7.4）包括0.2 g KH2PO4、2.9 g Na2HPO4·12H2O、0.2 g KCl、8.0 g NaCl、1 L蒸餾水；CB包被液（pH值 9.6）包括0.17 g Na2CO3、0.28 g NaHCO3、100 mL 去離子水；PBST洗滌液包括含0.05%Tween-20的PBS；封閉液包括含1%BSA的PBS；底物顯色A液包括 13.6 g CH3COONa、1.6 g C6H8O7·H2O、0.3 mL 30% H2O2、500 mL蒸餾水；底物顯色B液包括0.2 g EDTA-Na2、0.95 g C6H8O7·H2O、50 mL甘油、0.2 g TMB、500 mL蒸餾水；終止液：取濃H2SO4 27.62 mL緩緩加入到473 mL的蒸餾水中，混合即可，在加入硫酸的過程中不要加得太快，以免過熱。

1.1.3主要儀器UV-2450 紫外-可見分光光度計(jì)（島津分析儀器公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）。

1.2方法

1.2.1氟苯尼考人工抗原的合成氟苯尼考人工抗原的制備依據(jù)趙朋玲等的方法[15-16]：將14 mg BSA溶于4 mL 0.01 mol/L PBS（pH值7.4）中，磁力攪拌下逐滴加入1 mL DMF（含2 mg氟苯尼考胺）中，待混勻后，磁力攪拌下逐滴加入50μL 25%戊二醛于反應(yīng)液中，4 ℃下攪拌過夜，反應(yīng)液于4 ℃、pH值7.4 的PBS中透析72 h，每8 h換液1次；收集透析液中成分一半于4 ℃下保存供檢測(cè)用，一半于-20 ℃下保存供免疫用，合成路線如圖2所示。同法合成FFA-OVA包被原。

1.2.2人工抗原的鑒定紫外掃描法：用紫外分光光度計(jì)鑒定FFA與載體蛋白的偶聯(lián)是否成功。用PBS精確配制FFA、BSA和OVA標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后吸取一定量的FFA-BSA和FFA-OVA 儲(chǔ)備液，稀釋適宜倍數(shù)后，在200～400 nm下分別測(cè)定其吸光度，根據(jù)反應(yīng)前后紫外吸收光譜的變化情況判斷偶聯(lián)是否成功。

1.2.3人工抗原結(jié)合比的測(cè)定用紫外分光光度計(jì)確定氟苯尼考胺的最大吸收波長(zhǎng)，然后在氟苯尼考胺最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定人工抗原和載體蛋白的吸光度，按照如下公式[17]計(jì)算FFA-BSA和FFA-OVA的結(jié)合比：結(jié)合比=（ε偶聯(lián)物-ε載體蛋白）/ε半抗原，其中ε為摩爾吸光系數(shù)；ε=D/（c×b），其中D為吸光度，c為濃度，b為比色皿光徑。endprint

1.2.4人工抗體的制備免疫前先尾靜脈取血，作陰性對(duì)照。用FFA-BSA免疫6周齡BALB/C小鼠6只，背部皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為100 μg/只（即0.2 mL/只）[18]。首次免疫，取無菌PBS溶解的FFA-BSA，與等體積的弗氏完全佐劑混合，漩渦混合儀上充分乳化；強(qiáng)免疫，弗氏佐劑改用弗氏不完全佐劑，其余同前[19]。共免5次，每次間隔2周，每次免疫后第10天斷尾采血，最后一次免疫后第10天眼眶采血，4 ℃ 過夜析出血清，3 000 r/min下離心10 min，取上清[20-21]，一部分直接于4 ℃冰箱內(nèi)保存，一部分-20 ℃下保存?zhèn)溆?，收集的抗血清用硫酸胺法進(jìn)行純化[20]。

1.2.5包被抗原濃度的選擇用棋盤滴定法確定最佳包被濃度：用包被緩沖液將包被抗原作系列稀釋，濃度分別為10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5 μg/mL；用抗體稀釋液將二免后抗血清作倍比稀釋，濃度分別為1 ∶800、1 ∶1 600、1 ∶3 200、1 ∶6 400、1 ∶12 800、1 ∶25 600、1 ∶51 200。在96孔板上從左到右依次加入包被抗原，從上到下依次加入抗血清。按所建立的間接ELISA方法進(jìn)行操作，D值選取1.0左右，且以處在曲線平臺(tái)下降的那一點(diǎn)包被濃度作為最佳抗原抗體稀釋條件[20]。

1.2.6間接ELISA法測(cè)抗體效價(jià)操作步驟：（1）抗原包被。將包被原用包被液稀釋至最佳包被濃度。100 μL/孔加入到聚苯乙烯酶聯(lián)檢測(cè)板各孔中，37 ℃包被2 h，洗滌2次，5 min/次，拍干。（2）封閉。加入封閉液200 μL/孔，37 ℃封閉3 h，洗滌3次，拍干。（3）加待測(cè)樣品。倍比稀釋的五免抗血清100 μL/孔，以正常小鼠陰性血清作對(duì)照，37 ℃孵育 30 min，洗滌3次，拍干。（4）加二抗。用封閉液將辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG稀釋，100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，洗滌3次，拍干。（5）顯色。加入A、B液各80 μL/孔，37 ℃顯色15 min。（6）終止。加入終止液80 μL/孔。（7）讀數(shù)。在450 nm單波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的D值，以與陰性對(duì)照孔D值的比值（P/N）大于2.1為限，作為判斷效價(jià)的臨界點(diǎn)。

1.2.7間接ELISA法測(cè)抗體靈敏性用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗血清的特異性，采用本研究所確定的最佳包被濃度和抗體稀釋濃度，將“間接ELISA方法”中的第三步替換為“分別加入系列稀釋的FF標(biāo)準(zhǔn)品50μL/孔和最佳稀釋倍數(shù)的抗血清50 μL/孔，在37 ℃孵育30min，洗滌3次，拍干”。

1.2.8間接ELISA法測(cè)定抗體交叉反應(yīng)率用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)抗體的交叉反應(yīng)率。采用“1.2.6”節(jié)所確定的最佳包被濃度和抗體稀釋度，將“間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法”中的第三步替換為“分別加入系列稀釋的氯霉素、甲砜霉素或喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品50 μL/孔和最佳稀釋倍數(shù)的抗血清50 μL/孔，在 37 ℃ 孵育30 min，洗滌3次，拍干”。

2結(jié)果與分析

2.1紫外掃描結(jié)果鑒定

由圖3、圖4可以看出，F(xiàn)FA-BSA和FFA-OVA的紫外吸收光譜不同于FFA、BSA和OVA的紫外吸收光譜。FFA在266、273 nm處有2個(gè)吸收峰，最大吸收峰在266 nm處；而BSA、OVA的最大吸收峰分別在278、279 nm處；與FFA、BSA和OVA相比，偶聯(lián)物FFA-BSA和FFA-OVA的吸收曲線發(fā)生了變化，最大吸收峰分別為274、270 nm，且在FFA和BSA、OVA的最大吸收范圍內(nèi)，說明半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功，這與趙朋玲等的報(bào)道[15]一致。

2.2人工抗原結(jié)合比

結(jié)合FFA、載體蛋白及人工抗原的紫外吸收數(shù)據(jù)計(jì)算出FFA-BSA和FFA-OVA的結(jié)合比，分別為12 ∶1和11 ∶1。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，載體蛋白與連接的半抗原分子數(shù)量在 1 ∶（5～25）[22]的范圍內(nèi)能獲得良好的免疫效果。比例過低，會(huì)因空間屏蔽作用阻礙抗原抗體的免疫反應(yīng)而降低檢測(cè)的靈敏度；比例過高，則會(huì)增加偶聯(lián)物制備過程中的麻煩，且會(huì)降低免疫誘導(dǎo)質(zhì)量[20]。本試驗(yàn)合成的免疫原結(jié)合比為12 ∶1，正好在這個(gè)范圍內(nèi)，說明合成的免疫原有較好的免疫效果。

2.3最佳包被濃度的確定

選擇D值隨包被濃度降低而突然降低且在1.0左右的那一點(diǎn)的包被濃度，由表1可知，最佳包被濃度為2 μg/mL。

2.4血清效價(jià)的測(cè)定

由表2可知，經(jīng)過多次免疫后，6只小鼠的效價(jià)均在 32 000 以上，說明注射的抗原均達(dá)到了良好的免疫效果，也驗(yàn)證了人工抗原偶聯(lián)成功。

2.5抗體敏感性測(cè)定

圖5為氟苯尼考對(duì)抗體的抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線。該曲線呈“S”形，與Luo等的報(bào)道[2]相似。曲線中間線性部分的線性回歸方程為y=-0.372 8x+1.084 3，r2=0.994 4。根據(jù)回歸方程計(jì)算出半抑制率（IC50，是抑制率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的藥物濃度，IC50越低，說明抗體的特異性越強(qiáng)）為36.9 ng/mL。由圖5可知，該抗體與氟苯尼考表現(xiàn)出很好的親和性。

2.6抗體交叉反應(yīng)率的測(cè)定

由表3可知，制備的抗體與結(jié)構(gòu)相似的甲砜霉素有較小的交叉反應(yīng)，與氯霉素、結(jié)構(gòu)不相似的喹乙醇幾乎無交叉反應(yīng)。

3結(jié)論與討論

3.1氟苯尼考人工抗原的制備和鑒定

免疫識(shí)別要求免疫原至少要有2個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，因此免疫原分子必須相當(dāng)大，所以小分子物質(zhì)（分子量<2 500[23]）不能產(chǎn)生免疫應(yīng)答[20]。氟苯尼考分子量為358.22，屬于小分子物質(zhì)，必須與大分子物質(zhì)偶聯(lián)才能使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。由于氟苯尼考在結(jié)構(gòu)上既無羧基又無氨基，必須先進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，才能與蛋白偶聯(lián)。但改造時(shí)須盡可能保留其特征結(jié)構(gòu)，并引入合適的間隔臂和與載體蛋白偶聯(lián)的活性基團(tuán)。常用的改造方法有[15]：一是利用FF分子上所帶的羥基合成含CO—NH鍵的抗原；二是用強(qiáng)堿水解氟苯尼考分子為氟苯尼考胺，再與含醛基的物質(zhì)、載體蛋白的氨基以共價(jià)鍵相連。本試驗(yàn)選用戊二醛一步法，氟苯尼考胺為半抗原合成人工抗原，操作簡(jiǎn)單、易行。載體蛋白的選擇也是抗原合成的重要因素，本試驗(yàn)選擇BSA作為免疫原的載體，OVA作包被原的載體，它們的親緣性較遠(yuǎn)，可以減少和避免交叉反應(yīng)，且都價(jià)廉易得[24]。endprint

用于人工抗原的鑒定方法有很多，包括紫外光譜法[18]、紅外光譜法[24]、SDS-PAGE電泳[21]、基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜法[21]及免疫鑒定分析[15，25]等。其中，紫外光譜法最簡(jiǎn)便、快速且不會(huì)消耗樣品[20]，所以常被使用。本研究用紫外光譜法對(duì)人工抗原、半抗原與載體蛋白紫外吸收光譜特征進(jìn)行鑒定，其吸收峰出現(xiàn)了平移，說明人工抗原合成成功；并根據(jù)吸光度計(jì)算出其分子中半抗原與載體的分子結(jié)合比率，分別為 12 ∶1、11 ∶1。另外，多克隆抗體的成功制備也驗(yàn)證了人工抗原的合成成功。

3.2FF多克隆抗體的制備及鑒定

人工制備的抗體可分為單克隆抗體和多克隆抗體。前者由于生產(chǎn)成本高、試驗(yàn)周期長(zhǎng)、技術(shù)和條件要求苛刻，所以本研究選擇制備多克隆抗體。多克隆抗體存在于免疫動(dòng)物的血清中，一般多用兔子作為免疫動(dòng)物，這樣可以獲得足夠的血清。由于本研究?jī)H需少量抗體，且小鼠飼養(yǎng)方便、成本低、操作方便，少量的免疫原即可產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，所以本研究選用6周齡清潔級(jí)BALB/C小鼠為免疫動(dòng)物[26]。

免疫劑量和免疫方式對(duì)免疫效果和抗體效價(jià)具有較大的影響，一般認(rèn)為1 kg體質(zhì)量1次免疫1 mg左右的半抗原-蛋白質(zhì)免疫原[20]，免疫劑量過低不會(huì)發(fā)生免疫反應(yīng)，而過高的免疫原又會(huì)產(chǎn)生免疫耐受。本試驗(yàn)選用100 μg/（只·次）的注射劑量，該劑量在Erhard等認(rèn)為的最佳免疫劑量范圍內(nèi)[27]。免疫方式的選擇決定了抗原的吸收、分布和代謝速度，常用的免疫方式有背部皮下多點(diǎn)免疫、腹腔、皮內(nèi)、肌肉、靜脈、脾臟和淋巴結(jié)免疫等。一般認(rèn)為，小分子物質(zhì)合成的人工抗原適合背部皮下多點(diǎn)免疫[22]。

本試驗(yàn)對(duì)制備的抗血清進(jìn)行純化、分析，獲得了氟苯尼考的多克隆抗體，結(jié)果顯示該抗體有較高的特異性和靈敏性，IC50值達(dá)到36.9 ng/mL，能夠滿足建立快速檢測(cè)試紙條的要求[28-29]，可用于下一步試驗(yàn)。

本試驗(yàn)將氟苯尼考的改造體氟苯尼考胺與BSA和OVA合成人工抗原，經(jīng)紫外掃描鑒定，證明人工抗原合成成功。用其制備的多克隆抗體，測(cè)得IC50為36.9 ng/mL，與氟苯尼考有良好的親和性和特異性，為進(jìn)一步研究動(dòng)物源食品中氟苯尼考?xì)埩艨焖贆z測(cè)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

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