肉鴨重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re—6株）母源抗體消長規(guī)律及免疫程序研究

摘要：選取1 d健康無免疫肉鴨480羽，隨機分成A、B、C、D 4組，每組120羽。B組、C組、D組在10 d分別免疫0.5、0.8、1.0 mL H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗，A組為非免疫對照組。用HI方法檢測母源抗體、免疫抗體，根據(jù)母源抗體、免疫抗體消長規(guī)律，探討H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗的合理免疫程序。結(jié)果顯示：7 d之前，鴨群中90%以上的個體HI效價在4 log2及以上，獲得的母源抗體可以有效保護鴨群；14 d時，鴨群僅有56.7%的個體有保護性抗體；21 d還能夠檢測到極低的母源抗體，鴨群中6.7%的個體有一定的保護力；28 d之后，鴨群所有個體的HI效價均在4 log2以下，鴨群已經(jīng)喪失對禽流感病毒的抵抗力。

關(guān)鍵詞：肉鴨；H5N1高致病性禽流感；母源抗體；免疫抗體；消長動態(tài)；免疫程序；血凝抑制試驗

中圖分類號： S852.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0216-02

收稿日期：2014-02-23

基金項目：河南省科技攻關(guān)項目（編號：122102110022）。

作者簡介：馬超鋒（1981—），男，河南禹州人，碩士研究生，獸醫(yī)師，主要從事重大動物疫病防控研究。E-mail：machaofeng5@163.com。河南省信陽地區(qū)河網(wǎng)密布，非常適合養(yǎng)殖鴨鵝等水禽。近年來，信陽地區(qū)養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展迅猛，飼養(yǎng)量、存欄量逐年增長。肉鴨因其具有飼養(yǎng)周期短、成本低、出欄早等優(yōu)點，養(yǎng)殖規(guī)模在信陽市各縣區(qū)逐步擴大。目前，全市肉鴨存欄量已達1 800萬羽，年出欄量達5 000萬羽，均居河南省首位。隨著肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，鴨病尤其是病毒性疾?。單痢Ⅷ啿《拘愿窝?、鴨副黏病毒等）流行日趨嚴重，特別是禽流感對肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的打擊幾乎是毀滅性的。禽流行性感冒簡稱禽流感（avian influenza，AIV），是由禽流感病毒引起的1種人畜禽共患的傳染病。AIV根據(jù)其對家禽致病力的不同分為3種，即高致病性、低致病性、無致病性。H5N1高致病性禽流感病毒（HPAIV）是嚴重危害禽類的病原之一，對人類健康威脅較大，該亞型禽流感病毒是目前發(fā)現(xiàn)的禽流感病毒中感染性最強、致死率最高、流行范圍最廣的病毒，已在多個國家發(fā)生流行，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[1-2]?，F(xiàn)階段，疫苗接種仍是我國控制禽流感的主要措施之一[3]。根據(jù)農(nóng)業(yè)部及河南省畜牧局的要求，信陽地區(qū)從2012年5月開始，使用H5N1新型禽流感Re-6株疫苗對水禽進行防疫[4]。養(yǎng)殖戶在飼養(yǎng)周期內(nèi)何時免疫高致病性禽流感疫苗、劑量多少，國內(nèi)尚無相關(guān)研究。為探討重組禽流感病毒滅活疫苗（H5NI亞型，Re-6株）對肉鴨的免疫效果，根據(jù)國家強制免疫計劃及前人的研究，本研究采用不同劑量疫苗對相同日齡肉鴨進行免疫接種，并監(jiān)測抗體的消長規(guī)律，以制定合理的肉鴨免疫程序，旨在為預(yù)防、控制禽流感提供參考。

1材料與方法

1.1材料

重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株）由遼寧益康生物股份有限公司提供，批號：20130801。禽流感H5亞型（Re-6株）血凝抑制試驗診斷抗原（批號：2013005）、禽流感H5亞型（Re-6株）陰陽性血清（批號：2013004）。采集2～3羽無禽流感及新城疫等抗體的健康公雞自行配制1%雞紅細胞懸液。1日齡健康無免疫肉鴨480羽（河南省潢川縣華英集團某飼養(yǎng)場專人飼養(yǎng)）。將雛鴨隨機分成A、B、C、D 4組，每組120羽，A組為非免疫對照組，其余各組均為試驗組。B組、C組、D組于10日齡分別免疫0.5、0.8、1.0 mL重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株）。

1.2儀器

Eppendorf 10～1 000 μL單道移液器及25～300 μL多道移液器（德國Eppendorf公司），303系列電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海樹立儀器儀表有限公司），TDZ5-WS臺式低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）。

1.3方法

1.3.1采樣A、B、C、D 4組分別在1、7、14、21、28、35、42日齡通過翅靜脈采血，每組隨機抽取30羽采其血樣，每羽1～2 mL，分離血清后冷凍保存?zhèn)錂z。

1.3.2檢測采用血凝（HA）及血凝抑制試驗（HI）進行禽流感抗體檢測，按照GB/T 18936—2003 《高致病性禽流感診斷技術(shù)》規(guī)定的方法進行。禽流感病毒血凝試驗抗體檢測方法判定標準：以完全抑制4單位抗原的最高血清稀釋倍數(shù)為該血清的HI效價。當(dāng)陽性對照血清的HI效價與已知效價誤差不超過1個滴度，陰性對照血清的HI效價不高于2 log2時，試驗方可成立。被檢血清HI效價≤3 log2判為陰性；效價=4 log2判為可疑（可疑樣品應(yīng)重檢，重檢效價≥4 log2 判為陽性，≤3 log2判為陰性）；效價≥5 log2判為陽性。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用算術(shù)平均數(shù)表示HI效價，采用抗體合格率表示群體免疫合格情況，群體免疫抗體陽性率達到70%判定為群體合格。采用one-way ANOVA分析差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1不同日齡肉鴨H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗母源抗體檢測情況

由表1可知，雛鴨母源抗體效價在1 d最高，平均值達 66 log2，保護力較好；隨著日齡增加，母源抗體開始下降，至14 d，HI平均值為3.87 log2，保護作用大大降低；28 d鴨群基本無母源抗體，已起不到保護作用。

2.2不同日齡肉鴨H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗保護性母源抗體群體合格率

由圖1可見，雛鴨1 d時，抗體合格率為96.7%；7 d時90%的個體達到保護要求；14 d時，30羽雛鴨中11羽抗體效價在4log2以下，抗體合格率下降至56.7%；21 d時只有2羽在4log2以上，鴨群保護率為6.7%；28 d以后，整個鴨群無有效禽流感保護性抗體。endprint

2.3H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗試驗組不同日齡肉鴨免疫抗體消長情況

由圖2、圖3可見，B組、C組、D組HI效價均值及抗體合格率均在14 d達到最低值，此后逐漸上升。對B組、C組、D組的HI效價均值進行生物統(tǒng)計分析，P=0.468>0.05，差異不顯著；對B組、C組、D組的抗體合格率進行生物統(tǒng)計分析，P=0.665>0.05，差異不顯著，就數(shù)值而言C組稍好。

3結(jié)論與討論

3.1肉鴨H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗母源抗體消長規(guī)律

研究表明，種鴨產(chǎn)生的免疫抗體可以通過卵黃傳遞給雛鴨，起到天然被動免疫的作用，保護雛鴨免受禽流感病毒的侵襲[5]。當(dāng)HI效價≥4 log2時，可以保護鴨體免受禽流感野毒感染。本研究表明，7 d之前，鴨群中90%以上的個體HI效價在4 log2及以上，獲得的母源抗體可以有效保護鴨群；14 d時，鴨群僅有56.7%的個體有保護性抗體；21日齡還能夠檢測到極低的母源抗體，鴨群中6.7%的個體有一定的保護力；28 d之后，鴨群所有個體的HI效價均在4 log2以下，鴨群已經(jīng)喪失對禽流感病毒的抵抗力。

3.2肉鴨H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗免疫程序

重組禽流感病毒滅活疫苗（H5NI亞型，Re-6株）是農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局根據(jù)病毒流行病學(xué)監(jiān)測情況、疫苗評估結(jié)果以及專家評審意見授權(quán)疫苗廠家生產(chǎn)的用于防控水禽禽流感的產(chǎn)品。家禽日齡及品種不同，對疫苗免疫的敏感性也不一致，HI抗體產(chǎn)生的時間、所能達到的高度及維持的時間也存在差別[6]。鴨的高致病性禽流感免疫一般需要2次免疫才能得到較高的免疫抗體[7]。由于肉鴨飼養(yǎng)周期短，45～60 d就出欄，免疫時機、劑量選擇顯得尤為重要。本研究表明，試驗期間3個試驗組的HI效價均值均在4 log2以上，0.8 mL組及 1 mL 組的抗體合格率都在70%以上，10 d對肉鴨注射 0.8 mL 疫苗是比較合理的免疫程序。本試驗中，禽流感抗體水平一直偏低，鴨群中個體達到9 log2或10 log2滴度的很少，一方面可能與鴨對重組禽流感病毒滅活疫苗（H5NI亞型，Re-6 株）敏感性較低有關(guān)，另一方面與水禽血清中可能存在某種非特異性的凝集因子對雞紅細胞有非特異性凝集作用有關(guān)[8]。禽流感對鴨群危害極大，一旦發(fā)病，會造成巨大的經(jīng)濟損失。為提高禽流感疫苗對肉鴨的免疫效果，建議采取以下措施：疫苗的免疫接種要嚴格按照說明書進行，免疫注射時，要輕逮輕放；提高禽群的免疫力、抗應(yīng)激能力，免疫前后，給禽群的飲水或飼料中添加黃芪多糖、植物血凝素、蜂靈散等免疫促進劑促進鴨群免疫應(yīng)答，添加適量的電解多維等營養(yǎng)性藥物以提高禽群抗應(yīng)激能力[9]；加強對防疫人員的培訓(xùn)，確保免疫效果、免疫密度。

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