硒中毒對(duì)雛鵝免疫機(jī)能的影響

黃東璋　劉明生　王健　甘輝群　譚菊

摘要：為研究硒中毒對(duì)雛鵝免疫機(jī)能的影響，在基礎(chǔ)日糧中按2.0、5.0 mg/kg添加亞硒酸鈉（試驗(yàn)組），以飼喂基礎(chǔ)日糧為對(duì)照組，并于試驗(yàn)開始后7、14、21、28、35、42 d每組隨機(jī)抽取6羽鵝，分別空腹稱體質(zhì)量后自心臟采血 5 mL，用于T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測(cè)定和血清中與自由基有關(guān)酶的測(cè)定，之后捕殺，摘取胸腺、脾臟、法氏囊，用于計(jì)算免疫器官指數(shù)。結(jié)果表明，硒中毒時(shí)雛鵝血清中GSH-PX、SOD、CAT活性，GSH含量與對(duì)照組相比顯著或極顯著減少（P<0.05 或P<0.01），而MDA的含量則顯著或極顯著增加（P<0.05或P<0.01），同時(shí)，試驗(yàn)組雛鵝的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著下降（P<0.05），免疫器官指數(shù)顯著或極顯著降低（P<0.05或P<0.01）。這表明硒中毒時(shí)雛鵝的免疫機(jī)能低下，抗病力降低，自由基產(chǎn)生增多，與自由基清除有關(guān)的酶活性降低，過氧化物產(chǎn)生增多，最后導(dǎo)致機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，甚至死亡。

關(guān)鍵詞：雛鵝；硒中毒；血清酶；淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率；免疫器官指數(shù)

中圖分類號(hào)： S852.4+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0218-03

收稿日期：2014-04-08

作者簡(jiǎn)介：黃東璋（1981—），男，江蘇射陽人，碩士，講師，主要從事畜禽疫病防控研究。Tel：（0523）86158007；E-mail：112571065@qq.com。 硒是動(dòng)物必需的一種微量營(yíng)養(yǎng)元素，參與許多重要的生物進(jìn)程。硒具有很強(qiáng)的抗氧化能力，并且與維生素 E 具有協(xié)同作用，保護(hù)細(xì)胞及線粒體膜免受氧自由基的損害[1]。現(xiàn)在一般認(rèn)為，硒可能是作為免疫系統(tǒng)的非特異性刺激因子，參與調(diào)節(jié)免疫功能狀態(tài)，以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。但生產(chǎn)實(shí)踐中，在防治動(dòng)物硒缺乏病時(shí)，由于補(bǔ)硒方法不當(dāng)，如一次補(bǔ)硒過多，補(bǔ)硒時(shí)間過長(zhǎng)，或硒與飼料混合不均勻等而發(fā)生硒中毒的事例也時(shí)有發(fā)生[2]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)畜禽硒中毒的研究報(bào)道較多，但主要集中豬、雞等動(dòng)物的病理學(xué)和血清酶等方面[3-6]，而硒中毒對(duì)鵝免疫機(jī)能的影響還未見報(bào)道。本試驗(yàn)以健康蘇牧1號(hào)白鵝為試驗(yàn)動(dòng)物，研究硒中毒時(shí)對(duì)雛鵝免疫機(jī)能的影響，為臨床防治鵝硒中毒提供試驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1主要儀器

XSP-4C 雙目生物顯微鏡（上海炳宇光學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)），紫外分光光度計(jì)（751GD，上海儀電分析儀器有限公司生產(chǎn)），低溫超速離心機(jī)（TGL-16B，揚(yáng)州科能電力電子設(shè)備有限公司生產(chǎn)），漩渦混勻攪拌器（XW-80A，上海精科實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)），電熱恒溫水浴箱（TZL-5005，蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)），精密天平（UX220H，日本島津有限公司生產(chǎn)）。

1.2主要藥品與試劑

亞硒酸鈉（Na2SeO3·5H2O），分析純，含量（以干基計(jì)）98.7%，含硒（以干基計(jì)）45.5%，由江蘇倍康藥業(yè)有限公司提供；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；PHA（植物血凝素），購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清，購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)液，購(gòu)自美國(guó)CORNING公司。

1.3試驗(yàn)動(dòng)物

1日齡蘇牧1號(hào)健康雛鵝180羽，由江蘇畜牧科技示范園提供。

1.4日糧的配制及日糧硒水平

試驗(yàn)采用玉米-餅粕型基礎(chǔ)日糧，其營(yíng)養(yǎng)組成除了硒之外，均參照蘇牧1號(hào)白鵝營(yíng)養(yǎng)需要進(jìn)行配比（表1），同時(shí)根據(jù)GB/T 13883—2008硒測(cè)定法測(cè)定基礎(chǔ)日糧中硒的含量。

1.5試驗(yàn)方法

1.5.1飼養(yǎng)方法與分組將1日齡試驗(yàn)鵝預(yù)飼1周，然后將180羽健康無疾病試驗(yàn)鵝隨機(jī)分為3組，每組60羽。其中Ⅰ組為對(duì)照組，喂基礎(chǔ)日糧；Ⅱ組、Ⅲ組為試驗(yàn)組，在基礎(chǔ)日糧中分別添加亞硒酸鈉2.0、5.0 mg/kg。鵝自由采食和飲水，用藥和防疫按鵝場(chǎng)常規(guī)程序進(jìn)行，連續(xù)飼喂，試驗(yàn)期42 d。

1.5.2樣品的采集與處理分別于試驗(yàn)開始后7、14、21、28、35、42 d每組隨機(jī)抽取6羽鵝，分別空腹稱質(zhì)量后自心臟采血5 mL，采血時(shí)間統(tǒng)一于08：00—09：00進(jìn)行。所采血樣分為2份，1份用EDTA-Na2抗凝，用于T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測(cè)定；另1份不加抗凝劑，常規(guī)分離血清，置于4 ℃冰箱，用于血清中與自由基有關(guān)酶（GSH-PX、SOD、CAT、）活力及GSH含量、MDA含量的測(cè)定。之后捕殺，摘取胸腺、脾臟、法氏囊，用于計(jì)算免疫器官指數(shù)。

1.5.3主要檢測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.3.1血清酶測(cè)定按試劑盒說明書方法進(jìn)行，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.5.3.2T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測(cè)定RPMI 1640培養(yǎng)液，用前調(diào)至含胎牛血清10%、青霉素100 IU/mL、鏈霉素 100 IU/mL，用NaHCO3調(diào)pH值至7.2～7.4；PHA用RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液配成1 mg/mL。取無菌肝素抗凝血0.1 mL，加入1.8 mL RPMI 1640培養(yǎng)液中，同時(shí)加入PHA 0.1 mL，將細(xì)胞置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每天搖動(dòng)1次。2 500 r/min 離心10 min，棄上清液，留0.2 mL沉淀細(xì)胞制片，迅速吹干。姬姆薩染色10～20 min，水洗，干燥，油鏡觀察。順序計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，分別記錄轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率：淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)/200個(gè)淋巴細(xì)胞×100%。

1.5.3.3免疫器官指數(shù)測(cè)定各組鵝分別于7、14、21、28、35、42 d撲殺，摘取法氏囊、脾臟、胸腺，并稱其質(zhì)量。免疫器官指數(shù)=免疫器官鮮質(zhì)量（g）/鵝宰前空腹質(zhì)量。endprint

1.6數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2.1硒中毒對(duì)雛鵝血清酶的影響

由表2可知，試驗(yàn)組（Ⅱ和Ⅲ組）GSH-PX活性與對(duì)照組（Ⅰ組）相比均減少，且于試驗(yàn)21 d時(shí)呈顯著差異（P<0.05），28、35、42 d時(shí)呈極顯著差異（P<0.01），而試驗(yàn)組Ⅱ組和Ⅲ組之間，除42 d時(shí)差異顯著外，其余均不顯著（P>005）；試驗(yàn)組（Ⅱ和Ⅲ組）SOD活性與對(duì)照組相比均減少，且于試驗(yàn)21、28 d時(shí)呈顯著差異（P<0.05），35、42 d時(shí)呈極顯著差異（P<0.01），試驗(yàn)組Ⅱ組和Ⅲ組之間，35、42 d時(shí)差異極顯著，其余均不顯著（P>0.05）；試驗(yàn)組（Ⅱ和Ⅲ組）GSH值與對(duì)照組相比均減少，且于試驗(yàn)21 d時(shí)呈顯著差異（P<005），28、 35、42 d時(shí)呈極顯著差異（P<0.01），而試驗(yàn)組Ⅱ組和Ⅲ組之間，42 d時(shí)差異極顯著，其余均不顯著（P>005）；試驗(yàn)組（Ⅱ和Ⅲ組）CAT值與對(duì)照組相比均減少，且于試驗(yàn)28 d時(shí)呈顯著差異（P<0.05），35、42 d時(shí)呈極顯著差異（P<0.01），而試驗(yàn)組Ⅱ組和Ⅲ組之間，差異均不顯著（P>005）；試驗(yàn)組（Ⅱ和Ⅲ組）MDA含量與對(duì)照組相比均增加，且于試驗(yàn)7、14 d時(shí)呈顯著差異（P<0.05），21、28、35、42 d時(shí)呈極顯著差異（P<0.01），而試驗(yàn)組Ⅱ組和Ⅲ組之間，差異均不顯著（P>0.05）。

2.2硒中毒對(duì)雛鵝T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

試驗(yàn)組（Ⅱ和Ⅲ組）各日齡雛鵝淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與對(duì)照組相比，均呈下降趨勢(shì)。其中，14 d時(shí)，試驗(yàn)組（Ⅱ和Ⅲ組）雛鵝淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與對(duì)照組相比差異均顯著（P<0.05）；21、28、35、42 d時(shí)日齡時(shí)，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異均極顯著（P<0.01），而試驗(yàn)組Ⅱ組與Ⅲ組之間，除28 d時(shí)差異顯著外，其余均不顯著（P>0.05）（表3）。

2.3硒中毒對(duì)雛鵝免疫器官指數(shù)的影響

從表4可以看出，試驗(yàn)組（Ⅱ組、Ⅲ組）雛鵝法氏囊、脾臟和胸腺的器官指數(shù)較對(duì)照組均有不同程度的下降。其中，法氏囊器官指數(shù)，21 d和42 d時(shí)，2個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異均顯著（P<0.05），28 d和35 d時(shí)，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異均極顯著（P<0.01），而試驗(yàn)Ⅱ組與Ⅲ組之間，28 d時(shí)差異極顯著（P<0.01），42 d時(shí)差異顯著（P<0.05），其余均不顯著（P>0.05）；脾臟器官指數(shù)，21 d時(shí)，2個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組相比均呈顯著差異（P<0.05），28、35、42 d時(shí)，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異極顯著（P<0.01），而試驗(yàn)Ⅱ組與Ⅲ組之間，除42 d時(shí)，差異顯著（P<0.05）外 其余均不顯著；胸腺器官指數(shù)，14、21、28 d時(shí)，2個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異均顯著（P<0.05），35 d和42 d時(shí)，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比 差異均極表3硒中毒對(duì)雛鵝T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響顯著（P<0.01），而試驗(yàn)Ⅱ組與Ⅲ組之間，28、35 d時(shí)差異顯著（P<0.01），其余均不顯著（P>005）。

3討論

3.1硒中毒對(duì)雛鵝血清與自由基有關(guān)酶的影響

自由基是機(jī)體進(jìn)行生命活動(dòng)時(shí)所產(chǎn)生的一種活性分子。當(dāng)機(jī)體處于疾病狀態(tài)時(shí)，都會(huì)引起自由基產(chǎn)生過量，而體內(nèi)過多的自由基可引起蛋白質(zhì)、核酸（DNA）變性，導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官損傷，誘發(fā)各種疾病。

SOD是廣泛存在于需氧生物體內(nèi)的一種金屬酶，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化起重要作用，能催化超氧陰離子 （ O-2· ）產(chǎn)生歧化反應(yīng)，清除超氧陰離子 （ O-2· ）保護(hù)細(xì)胞免受損傷，SOD活力的測(cè)定可間接反應(yīng)機(jī)體清除自由基的能力。GSH-PX是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，是H2O2和ROOH的主要清除劑。它能特異地催化還原型谷胱甘肽 （GSH）對(duì)過氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。CAT是一種酶類清除劑，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶。它可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。MDA是一種脂質(zhì)過氧化物，是由生物體內(nèi)自由基攻擊生物膜產(chǎn)生的不飽和脂肪酸（PUFA）引起脂質(zhì)過氧化作用而形成的，這種產(chǎn)物還可通過生物體內(nèi)有機(jī)物反應(yīng)的鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻糯蠡钚匝醯钠茐淖饔?，引起?xì)胞代謝與功能障礙，甚至死亡。因此，測(cè)定機(jī)體中的MDA含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映細(xì)胞受損傷的程度[7]。本研究中硒中毒試驗(yàn)組雛鵝的GSH-PX、SOD、CAT等與自由基清除有關(guān)的酶的含量或活力與對(duì)照組相比均減少或降低，而MDA含量則增多，這與賀建忠等[3]報(bào)道的豬硒中毒時(shí)體內(nèi)自由基的變化和劉明生等[7]報(bào)道的肉雞硒中毒時(shí)體內(nèi)自由基的變化結(jié)果一致。

4.2硒中毒對(duì)雛鵝T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

T淋巴細(xì)胞表面有多種受體，在體外培養(yǎng)中加入特異性抗原或非特異性促有絲分裂原的刺激下，細(xì)胞代謝和形態(tài)可發(fā)生一系列變化，如能轉(zhuǎn)化成體積較大的原淋巴細(xì)胞。轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)量可反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能，測(cè)定T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答能力，診斷細(xì)胞免疫缺陷性疾病。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低常作為衡量機(jī)體免疫水平的指標(biāo)。本試驗(yàn)硒中毒試驗(yàn)組中雛鵝的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均降低，影響了機(jī)體的免疫功能。

4.3硒中毒對(duì)雛鵝免疫器官指數(shù)的影響

免疫器官是動(dòng)物執(zhí)行免疫功能的組織機(jī)構(gòu)，它們的發(fā)育狀況直接影響到機(jī)體免疫力的高低。臟器指數(shù)又稱臟體比，是動(dòng)物某臟器的質(zhì)量與其體質(zhì)量之比值。正常時(shí)各臟器與體質(zhì)量的比值比較恒定。臟器指數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；臟器指數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。因此免疫器官臟器系數(shù)可作為評(píng)價(jià)禽類免疫狀況的良好指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，硒中毒時(shí)，各免疫器官的臟器指數(shù)隨試驗(yàn)期的延長(zhǎng)明顯減小，且與對(duì)照組相比，差異顯著或極顯著。關(guān)于硒中毒時(shí)免疫器官的組織及形態(tài)學(xué)的變化將有待于進(jìn)一步研究。

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