王玫+任亮+孔平+顏懷玉+肇慧君+楊春光

摘要

提取DNA是利用PCR技術(shù)檢測纖維的關(guān)鍵技術(shù)難點。本文對山羊絨DNA的提取方法進(jìn)行了試驗，并通過PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行驗證。結(jié)果表明：使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 試劑盒，將纖維樣品盡量處理成粉末狀，并在樣品經(jīng)裂解液處理后先離心除去其中尚未完全溶解的纖維，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增是比較有利的，完全能夠得到滿足PCR擴(kuò)增要求的DNA樣品。

關(guān)鍵詞：山羊絨;DNA;提取方法;驗證

山羊絨是一種珍貴的動物纖維，山羊絨的價格比綿羊毛、馬海毛的價格高出很多倍，一些商家為了牟取利益，將細(xì)支綿羊毛、馬海毛等混紡產(chǎn)品冠以“純羊絨”的桂冠，使消費者上當(dāng)[1]。目前羊絨羊毛纖維普遍采用的鑒別方法是投影儀法、掃描電鏡法，其原理為通過纖維的外觀形態(tài)、微觀結(jié)構(gòu)辨別纖維種類，由于主觀因素大，準(zhǔn)確率不高[2]。利用PCR技術(shù)鑒別動物纖維是近年來的研究熱點，而DNA的提取是利用PCR技術(shù)檢測纖維的關(guān)鍵技術(shù)難點。

毛發(fā)中的DNA主要集中在毛囊細(xì)胞中，毛干部分僅含有少量線粒體DNA[3]。在從動物體上采集或脫落的毛發(fā)中，絕大多數(shù)都帶有完整的毛囊[4]。王慶林等研究表明從被毛毛囊細(xì)胞中提取DNA的最大缺點是獲得的DNA量非常少，如操作不慎，就有可能提取不到DNA[5]。毛干相對于毛囊，其DNA含量更少，幾乎所有成分都是角蛋白，但作為動物組織，毛干具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如果提取方法得當(dāng)仍可以獲得一定量的DNA[6]。吳云良通過對細(xì)胞的煮沸和冷卻，使細(xì)胞破裂、蛋白質(zhì)變性，從而獲得用于PCR擴(kuò)增的模板DNA的法為提取東北虎毛發(fā)中DNA[7]。徐懷亮等提出一種快捷、簡便、經(jīng)濟(jì)、高效、安全、有效的提取藏酋猴毛干中DNA的方法——納米磁珠法，并指出進(jìn)行毛發(fā)取樣時以5～10根較為合適[8]。目前，國內(nèi)從動物毛皮中提取DNA的方法，主要采用經(jīng)典的DNA提取技術(shù)：蛋白酶K法裂解結(jié)合酚-氯仿抽提[9];研究對象主要是一些珍稀動物如小熊貓[10]、鬣羚[11]、麝科動物[12]、揚子鱷[13]等的陳舊毛皮標(biāo)本。雖然有關(guān)毛干DNA提取的報道已屢見不鮮，但由于毛干DNA含量低、髓質(zhì)層與皮質(zhì)層中含大量色素不易與DNA分離而抑制PCR擴(kuò)增等問題[14-15]，常造成DNA提取、純化困難，導(dǎo)致分子生物學(xué)相關(guān)研究受到限制，影響下游工作。關(guān)于山羊絨DNA提取方面的報道較少，本文對山羊絨DNA提取方法進(jìn)行了試驗與研究，采用PCR擴(kuò)增的手段對方法的可靠性進(jìn)行驗證。

1 ? ?試驗材料與儀器

1.1 ?試劑

試驗用水應(yīng)符合GB/T ?6682中一級水的規(guī)格，組織和毛發(fā)提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（TaKaRa Code.9765），Premix Ex Taq? （Probe qPCR） （TaKaRa Code. RR390A），100%乙醇，DNA Laddar Marker。

1.2 ?儀器與設(shè)備

冰箱：4℃～20℃，天平：感量0.0001g，分析研磨機，剪刀，恒溫水浴鍋，離心機（12000 rpm），渦旋混合器，微量可調(diào)移液器：0.1μL～2.5μL，1μL～10μL，2μL～20μL，10μL～100μL，20μL～200μL，100μL～1000μL，1.5mL離心管，超凈工作臺，PCR儀，實時熒光定量PCR儀，電泳裝置，凝膠成像儀。

2 ? ?試驗方法與步驟

2.1 ?取樣

從山羊絨制品的不用部位取樣，共取約1 g試樣。

2.2 ?制樣

用剪刀將樣品剪碎，經(jīng)分析研磨機打散混勻，再用剪刀盡量剪碎至2 mm以下，再次用分析研磨機混勻。

2.3 ?DNA的提取

從混勻的樣品中稱取約5 mg試樣，放入2 mL離心管中，每個樣平行提取兩管，提取步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，此處不贅述。提取過程注意如殘存纖維狀組織無法完全裂解，裂解之后先12000 rpm離心2分鐘，去除雜質(zhì)之后再進(jìn)行后續(xù)操作。提取試劑盒由寶生物工程（大連）有限公司提供，試劑盒型號TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0。

2.4 ?引物探針信息

本文所用的引物和探針均由TakaRa寶生物工程（大連）有限公司合成，具體見表1。

表1 ? ?山羊絨成分熒光定量PCR引物及探針

3 ? ?結(jié)果與分析

3.1 ?DNA提取效果

DNA提取結(jié)束后對其進(jìn)行DNA電泳以確保其DNA的提出，具體結(jié)果見圖1。 由圖1可見，提取的DNA擴(kuò)增條帶清晰，提取效果良好。

圖1 ? ?提取山羊絨DNA電泳圖

2μLApplied，1%Agarose;M：DNA Marker λ-Hind III digest;1-2：山羊絨DNA

3.2 ?引物特異性驗證

在優(yōu)化好的PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系下，以鴨絨、鵝絨、綿羊毛、兔毛、山羊絨、牦牛絨、羊駝毛的DNA為特異性試驗對照進(jìn)行PCR檢測。電泳結(jié)果顯示，僅有山羊絨被擴(kuò)增出條帶，而陰性對照未擴(kuò)增出條帶，證明山羊絨引物的特異性良好，將其應(yīng)用于PCR方法，山羊絨成分可以從其他纖維中有效地鑒別出來，具體結(jié)果見圖2。圖2所顯示的擴(kuò)增片段大小約是300bp，大小符合所設(shè)計的引物片段大小303bp，且陰性對照和其他非山羊絨模板對照均未出現(xiàn)特異性條帶。

1 ? 2 ? ?3 ? 4 ? ?5 ? 6 ? ?7 ? 8 ? M

圖2 ? ?PCR特異性檢測結(jié)果

5μL Applied， 3% Agarose，M：100bp DNA Laddar Marker;1：鴨絨PCR產(chǎn)物;2：鵝絨PCR產(chǎn)物;3：綿羊毛PCR產(chǎn)物;4：兔毛PCR產(chǎn)物;5：山羊絨 PCR產(chǎn)物;6：牦牛絨PCR產(chǎn)物;7：羊駝毛PCR產(chǎn)物;8：陰性對照（Negative Control）。

3.3 ?檢測體系及結(jié)果

3.3.1 ?反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

（1） PCR反應(yīng)體系

以提取的山羊絨DNA為模板，每次反應(yīng)均設(shè)陰性對照和陽性對照。實時熒光PCR反應(yīng)體系25 μL，具體見表2。

表2 ? ?熒光定量PCR反應(yīng)體系

注： Negative control反應(yīng)時，加入RNase free dH2O;Positive反應(yīng)時，做兩個平行樣。

（2）反應(yīng)條件

本試驗建立的熒光定量PCR初步反應(yīng)參數(shù)包括預(yù)變性、變性、退火延伸三步。實時熒光定量PCR初步反應(yīng)參數(shù)見表3。

表3 ? ?熒光定量反應(yīng)條件參數(shù)

ABI 7500 Fast Real Time System熒光定量PCR儀完全封閉操作，儀器可以直接讀數(shù)，熒光定量PCR熒信號在每一循環(huán)延伸步驟完成后收集，并立即顯示出結(jié)果，可實時觀察每一循環(huán)收集熒光信號的強度。

3.3.2 ?檢測結(jié)果

（1） Ct值及結(jié)果判定

在優(yōu)化好的熒光PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系下，選擇鴨絨、鵝絨、綿羊毛、兔毛、山羊絨、牦牛絨、羊駝毛的DNA為特異性試驗的對照來進(jìn)行熒光PCR檢測。檢測結(jié)果顯示，僅山羊絨Ct值為26.125，而其他樣品及陰性對照無Ct值，Ct值及結(jié)果判定見表4。

（2） 熒光PCR檢測特異性試驗結(jié)果

在優(yōu)化好的熒光PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系下，選擇鴨絨、鵝絨、綿羊毛、兔毛、山羊絨、牦牛絨、羊駝毛的DNA為特異性試驗的對照來進(jìn)行熒光PCR檢測。檢測結(jié)果顯示，僅山羊絨有擴(kuò)增曲線，而其他對照以及空白對照均沒有擴(kuò)增曲線，表明本試驗設(shè)計的特異性引物和探針與山羊基因具有較高同源性，而與其他常見動物物種的基因并沒有同源性，該檢測方法具較強的特異性。具體結(jié)果見圖3。

圖3 ? ?山羊絨DNA熒光PCR結(jié)果

4 ? ?結(jié)論

本文使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 試劑盒提取山羊絨DNA，經(jīng)檢測驗證，DNA擴(kuò)增曲線良好，電泳條帶清晰，空白對照是陰性結(jié)果，引物對在其他幾種動物纖維體系內(nèi)，包含鴨絨、鵝絨、綿羊毛、兔毛、牦牛絨和羊駝毛，沒有擴(kuò)增。引物探針反應(yīng)性能和特異性良好，該試劑盒提取山羊絨纖維DNA可以用于山羊絨檢測。試驗時將纖維樣品盡量處理成粉末狀，并在樣品經(jīng)裂解液處理后先離心除去其中尚未完全溶解的纖維，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增是比較有利的，完全能夠得到滿足PCR擴(kuò)增要求的DNA樣品。

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（作者單位：遼寧出入境檢驗檢疫局）