朱 天，張 芳，李姣姣，張珊珊，張書洲，盧神州*

(1蘇州大學紡織與服裝工程學院，江蘇 蘇州 215021；2蘇州絲瑞寶生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215122)

枯草菌脂肽鈉/絲素蛋白復合水凝膠的研究

朱 天1，張 芳1，李姣姣1，張珊珊1，張書洲2，盧神州1*

(1蘇州大學紡織與服裝工程學院，江蘇 蘇州 215021；2蘇州絲瑞寶生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215122)

為滿足水凝膠材料在生物醫(yī)學領域的應用要求，需要制備一種凝膠時間較短、孔徑較大且孔隙率高、生物相容性好的水凝膠材料。采用枯草菌脂肽鈉誘導絲素蛋白溶液形成水凝膠，探討不同濃度枯草菌脂肽鈉對形成凝膠時間的影響，并采用SEM觀察水凝膠內(nèi)部形貌、FTIR、XRD表征水凝膠聚集態(tài)結(jié)構，通過在水凝膠表面培養(yǎng)成纖維細胞評價其生物相容性。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，水凝膠的膠凝時間與枯草菌脂肽鈉濃度成反比，水凝膠中孔徑較大且孔隙率高，在凝膠上L929成纖維細胞呈對數(shù)穩(wěn)定增長，生物相容性良好。該絲素蛋白復合水凝膠在組織修復、創(chuàng)傷治愈等生物醫(yī)學領域具有較大潛力。

水凝膠；絲素蛋白；枯草菌脂肽鈉；生物相容性

水凝膠是一種以水為分散介質(zhì)的三維網(wǎng)絡大分子材料，不溶不熔，在其中包裹著大量的水分[1]。三維多孔網(wǎng)絡結(jié)構使小分子物質(zhì)能夠在這些框架空隙中擴散、遷移。它可以看成是聚合物的濃溶液，又可以認為是高彈性的固體，有一定強度可以保持形態(tài)且柔軟有彈性[2]，其應用涉及到生物醫(yī)藥、組織工程等領域。絲素蛋白是一種纖維狀蛋白，以其良好的熱穩(wěn)定性、優(yōu)異的機械性能和生物相容性等優(yōu)點在組織工程、創(chuàng)傷治愈和細胞增殖等領域備受關注。絲素蛋白水凝膠，作為一種天然高分子材料構成的三維網(wǎng)絡結(jié)構水凝膠，以良好的生物相容性、大量水含量和高度交聯(lián)的空間網(wǎng)絡結(jié)構、獨特的理化性質(zhì)及對細胞和小分子的透過性和擴散性[3]，使其在組織工程、創(chuàng)傷治愈和細胞增殖等領域具有廣闊的應用前景[4]。純絲素蛋白形成凝膠時間較長，且凝膠強度弱彈性差，一般通過物理、化學等方法促進凝膠形成。而通過化學交聯(lián)劑形成的水凝膠可能具有毒性，細胞相容性較差。所以通過物理交聯(lián)制備一種膠凝時間短、孔徑較大且孔隙率高、細胞相容性良好的絲素蛋白水凝膠材料對于生物醫(yī)學領域具有重大意義[5]。

脂肽類表面活性劑是由微生物代謝產(chǎn)生的一類具有強表面活性的生物表面活性劑。基于其良好的生物相容性，它們在醫(yī)藥、化妝品、環(huán)境保護和微生物采油等方面有良好的應用潛力[6]。枯草菌脂肽更是其中的佼佼者，它是由枯草芽孢桿菌株產(chǎn)生的脂肽類表面活性劑[7]，呈晶狀，有潛力作為抗腫瘤，抗病毒和抗支原體劑[8]。本文采用枯草菌脂肽鈉誘導絲素蛋白快速凝膠化。其與絲素蛋白溶液混合后，短時間內(nèi)可獲得內(nèi)部孔徑較大、細胞相容性較好的絲素蛋白水凝膠，為生物醫(yī)用領域提供一種新型水凝膠材料。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

家蠶生絲(蘇州先蠶絲綢生物科技有限公司)，枯草菌脂肽鈉(安徽帝元生物科技有限公司)，溴化鋰(天成化工有限公司)，無水碳酸鈉、碳酸氫鈉(國藥集團化學試劑有限公司)，小鼠成纖維細胞系L929細胞(蘇州大學醫(yī)學院)，小牛血清，RPMI-1640培養(yǎng)基(Wisent公司，加拿大)，阿爾瑪藍(sigma公司，美國)，透析袋(上海普宜生物技術有限公司，截留分子量8～10 kD)，實驗室用水均為去離子水。

1.2 絲素蛋白溶液制備

稱取80 g家蠶生絲，放入4 000 mL質(zhì)量濃度為1 g/L的碳酸鈉—碳酸氫鈉緩沖溶液中微沸30 min，取出蠶絲并用去離子水反復搓洗干凈，重復上述試驗兩次，將生絲表面的絲膠脫洗干凈。將脫膠后的絲素置于烘箱中在60 ℃的條件下烘干，即得干的純絲素纖維。將純絲素纖維在65±2 ℃下溶解于濃度為9.3 mol/L的溴化鋰溶液中，浴比為1:10，溶解時間約40 min。完全溶解并冷卻后將溶液裝入透析袋中，置于去離子水中，每隔兩小時換一次水，透析3～4 d即得純絲素溶液，放在4 ℃冰箱備用[9-10]。

1.3 水凝膠的制備

配制50 g/L的枯草菌脂肽鈉水溶液備用。將枯草菌脂肽鈉與絲素蛋白溶液以不同濃度混合，控制絲素蛋白溶液終質(zhì)量濃度為50 g/L，枯草菌脂肽鈉終質(zhì)量濃度分別為0 g/L、0.1 g/L、0.6 g/L、1 g/L、2 g/L、3 g/L。在離心管中充分混合后，放置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，充分反應形成具有一定力學強度和彈性的復合水凝膠。

1.4 表面張力測試

利用DataPhysics DCAT-21型表面張力儀，檢測37℃下不同濃度枯草菌脂肽鈉水溶液的表面張力(Surface Tension) ，采集數(shù)據(jù)并作出表面張力與表面活性劑濃度之間的關系曲線。

1.5 凝膠時間的測定

將絲素蛋白溶液與枯草菌脂肽鈉溶液按比例充分混合后，迅速取300 uL置于24孔板中，每組6個平行樣，放入Synergy HT 型多功能酶標儀中，選取Kinetics程序，在37 ℃下每分鐘測定對應樣品在550 nm下的吸光度(OD)值，用此來表征對應樣品的凝膠時間[11]。

1.6 水凝膠的形貌觀察

選取枯草菌脂肽鈉終質(zhì)量濃度為2 g/L，絲素蛋白終質(zhì)量濃度為30 g/L，制備枯草菌脂肽鈉/絲素共混水凝膠樣品。待凝膠穩(wěn)定后放入液氮中速凍，真空干燥后用切片器切取一定體積的凍干凝膠樣品，表面噴金90 s后取出，采用日本Hitachi S-4800型掃描電子顯微鏡觀察凝膠的表面和截面形貌[12]。

1.7 水凝膠的結(jié)構表征

將上述凍干的凝膠樣品研磨加工成直徑小于80 μm的粉末后，采用KBr壓片法制樣，在傅立葉變換紅外光譜儀上進行測試，掃描400～4 000 cm-1范圍內(nèi)的吸光度，得到紅外吸收光譜[13]；X-射線衍射測試，掃描速度為8°/min，掃描2θ = 5°～45°，得到樣品的廣角X射線衍射(WAXD)圖譜。

1.8 細胞相容性測試

實驗準備：對絲素蛋白溶液、一定濃度的枯草菌脂肽鈉水溶液和去離子水進行高壓滅菌處理，之后所有實驗均在無菌超凈臺內(nèi)進行。采用傳代后48～72 h生長旺盛的L929成纖維細胞[14-15]。體積分數(shù)為89% DMEM培養(yǎng)液，10%胎牛血清和1%抗生素(雙抗)。在96孔板中制備水凝膠，其中枯草菌脂肽鈉的濃度分別為0 g/L(即純絲素凝膠)、2 g/L，絲素蛋白濃度分別為30 g/L、40 g/L、50 g/L，每個樣品6孔。用DMEM配制1×10-4個/mL L929細胞懸液，待水凝膠穩(wěn)定成型2 h后，每孔加入80μL細胞懸液，再加入120μL培養(yǎng)液，在體積分數(shù)為5%的二氧化碳/空氣，溫度為37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d，隔兩天加換新鮮培養(yǎng)液200 μL。

細胞增殖活力的測定[16-17]：配制50 μmol/L的阿爾瑪藍溶液，與培養(yǎng)液1:10配制成阿爾瑪藍染色培養(yǎng)液。96孔板每孔加入200 μL，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)6 h后，取出100μL在酶標儀上測其熒光值強度，來表征細胞活性，激發(fā)波長530 nm，發(fā)射波長590 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 表面張力的變化

如圖1所示枯草菌脂肽鈉水溶液的表面張力隨其濃度的變化情況，可知枯草菌脂肽鈉水溶液的表面張力有明顯拐點，且在臨界膠束濃度(CMC)約為9×10-5mol/L ，即0.13 g/L時達到表面張力最低值為28.97 mN/m。這說明枯草菌脂肽鈉能明顯地降低水溶液中的表面張力，可在短時間內(nèi)誘導絲素蛋白形成水凝膠。當所選取的表面活性劑有明顯最低點時，其誘導絲素形成凝膠所需時間也最短[18]。

圖1 37 ℃下枯草菌脂肽鈉水溶液的表面張力隨其濃度的變化曲線

2.2 誘導絲素凝膠化時間

在37 ℃下，不同濃度的枯草菌脂肽鈉與絲素溶液混合后，其吸光度(OD)值隨時間的變化如圖2所示?？莶菥拟c濃度為0.6 g/L時即可誘導絲素蛋白形成水凝膠，但需時較長，約9 h；而當枯草菌脂肽鈉增大至1 g/L以上時，形成水凝膠所需時間在2 h以內(nèi)。這可能是隨著絲素蛋白溶液中枯草菌脂肽鈉濃度的增加，包裹在絲素蛋白周圍的表面活性劑不斷降低絲素蛋白分子間摩擦力，使絲素蛋白分子運動速度加快，碰撞幾率增大，大大縮短凝膠時間。圖2中曲線均在出現(xiàn)大幅增大后趨向穩(wěn)定，說明溶液向凝膠轉(zhuǎn)變的過程如下：枯草菌脂肽鈉與絲素溶液混合在開始階段處于溶液狀態(tài)，OD值較小；當OD值增大，渾濁度增加時表明凝膠開始形成；當OD值達到平衡時，說明凝膠過程已完成。

圖2 37 ℃不同枯草菌酯肽鈉濃度下絲素溶液的吸光度隨時間的變化曲線

圖2 37 ℃不同枯草菌脂肽鈉濃度下，絲素溶液的吸光度隨時間的變化曲線

2.3 凝膠的形貌觀察

圖3分別為純絲素凝膠截面形貌(A)和枯草菌脂肽鈉/絲素共混凝膠的截面形貌(B)。(B)圖中共混水凝膠的截面層次清晰，孔徑結(jié)構大致均勻，范圍在10～50 μm。與純絲素凝膠(A)相比，具有很多絲狀纖維，孔徑較大，且孔之間相互貫通，使枯草菌脂肽鈉/絲素共混凝膠水凝膠內(nèi)部水分和營養(yǎng)物質(zhì)傳輸更快，同時為細胞生長提供足夠的空間和適宜的環(huán)境。

圖3 純絲素凝膠截面形貌(A)和枯草菌脂肽鈉/絲素共混凝膠截面形貌(B)

2.4 水凝膠的聚集態(tài)結(jié)構

圖4(A)為純絲素纖維、純絲素溶液、純絲素水凝膠和枯草菌脂肽鈉/絲素蛋白水凝膠的紅外光譜圖(FTIR)。純絲素纖維中絲素蛋白的酰胺Ⅰ特征峰出現(xiàn)在1 630 cm-1，酰胺Ⅱ特征峰出現(xiàn)在1 520 cm-1，酰胺Ⅲ特征峰出現(xiàn)在1 230 cm-1，均是β-折疊吸收峰，說明絲素纖維以β-折疊結(jié)構為主[19]。純絲素溶液中酰胺Ⅰ特征峰出現(xiàn)在1 655 cm-1，酰胺Ⅱ特征峰出現(xiàn)在1 537 cm-1，酰胺Ⅲ特征峰出現(xiàn)在1 235 cm-1，這些都是無規(guī)卷曲吸收峰，說明絲素蛋白溶液中大部分為無規(guī)卷曲結(jié)構。在絲素纖維溶解為絲素蛋白溶液時，二級結(jié)構由β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲?？莶菥拟c/絲素水凝膠和純絲素凝膠的酰胺Ⅰ特征峰出現(xiàn)在1 628 cm-1，是β-折疊結(jié)構吸收峰，相對來說純絲素凝膠的吸收峰更尖銳，說明枯草菌脂肽鈉/絲素水凝膠中β-折疊結(jié)構含量相對較少；酰胺Ⅱ特征峰出現(xiàn)在1 533 cm-1和1 531 cm-1，這是α-螺旋結(jié)構吸收峰；酰胺Ⅲ特征峰出現(xiàn)在1 234 cm-1；兩者的酰胺Ⅴ特征峰出現(xiàn)在700 cm-1，這些均為β-折疊結(jié)構吸收峰?？莶菥拟c/絲素水凝膠的二級結(jié)構與純絲素凝膠更為相似，即絲素溶液轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，是無規(guī)卷曲向β-折疊結(jié)構的轉(zhuǎn)變，從而出現(xiàn)交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構，形成凝膠。

純絲素纖維、純絲素溶液、純絲素水凝膠和枯草菌脂肽鈉/絲素水凝膠的X-射線衍射曲線如圖4(B)。純絲素溶液只有20.7°附近有饅頭峰，基本為無規(guī)卷曲結(jié)構。純絲素纖維的吸收峰在9.1°，20.7°，并且很尖銳，為典型的SilkⅡ結(jié)晶結(jié)構[20]。純絲素凝膠在9.1°，20.7°，24.7°附近出現(xiàn)了吸收峰，而枯草菌脂肽鈉/絲素水凝膠主要吸收峰也在9.1°，20.7°。這些特征衍射峰表明枯草菌脂肽鈉/絲素水凝膠結(jié)構與純絲素纖維的結(jié)構相似，是SilkⅡ結(jié)晶結(jié)構。與FTIR結(jié)果一致，表明枯草菌脂肽鈉誘導絲素形成水凝膠的過程中，伴隨著無規(guī)卷曲結(jié)構向β-折疊結(jié)構的轉(zhuǎn)變。

圖4 傅立葉紅外吸收光譜圖(A)和X射線衍射曲線(B)純絲素纖維(a)、純絲素溶液(b)、純絲素凝膠(c)和枯草菌脂肽鈉/絲素共混凝膠(d)

2.5 細胞相容性

通過在所制備水凝膠表面培養(yǎng)細胞，測定培養(yǎng)液中阿爾瑪藍的熒光值變化來表征細胞活性，判斷水凝膠的細胞相容性[21]。圖5表示枯草菌脂肽鈉濃度為0g/L、2 g/L時L929細胞在不同濃度絲素蛋白水凝膠表面上的增殖情況。純絲素凝膠較復合凝膠表面細胞長勢稍差，基本接近細胞培養(yǎng)板的增值情況。隨著絲素蛋白濃度變化濃度，細胞增殖并沒有顯著性差異?？莶菥拟c/絲素水凝膠的細胞相容性良好，具備了用于組織修復的條件，并具有良好的應用前景。

圖5 不同絲素濃度與枯草菌脂肽鈉混合水凝膠表面的細胞在培養(yǎng)不同天數(shù)后的熒光值(FLU)，其中枯草菌脂肽鈉濃度均為2 g/L，絲素濃度分別為50 g/L，40 g/L，30 g/L，TCP為培養(yǎng)板作對照組

3 結(jié)論

多肽類表面活性劑枯草菌脂肽鈉可誘導絲素蛋白在短時間內(nèi)快速形成水凝膠。37℃下1 g/L的枯草菌脂肽鈉即可誘導絲素蛋白在1 h內(nèi)形成水凝膠?？莶菥拟c可以誘導絲素蛋白形成均勻的，較大的孔徑的水凝膠，有利于水分和營養(yǎng)成分的傳輸。L929細胞在水凝膠表面生長狀況良好，細胞相容性較好，為水凝膠醫(yī)用材料提供了新的基礎。

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江蘇省高校自然科學研究重大項目資助(15KJA540001)；江蘇省自然科學基金項目(BK20131176)

2014-09-01